端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子hTERT-U6嵌合啟動子siRNA表達載體的腫瘤靶向性實驗研究.pdf

1、目的： RNAi技術(shù)在腫瘤基因治療方面的研究已較廣泛，但是siRNA不具有靶向惡性腫瘤細胞的能力，造成RNAi效應的不確定性。端粒酶在多種惡性腫瘤細胞中高表達，正常細胞中除生殖細胞和造血細胞等外大多無或低表達[1]。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)是端粒酶活性的主要調(diào)控因素，對細胞惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤的發(fā)生發(fā)展意義重大[2]。因此，本研究擬構(gòu)建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動

2、子hTERT/U6嵌合啟動子siRNA表達體系，研究該表達體系對hTERT表達不同的細胞株的沉默效應，為探討基因的靶向治療奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.建立穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白(EGFP)的肝癌SMMC-7721細胞株和正常人成纖維細胞(HELF)細胞，供檢測轉(zhuǎn)染效率用。 2. 構(gòu)建兩條靶向EGFP基因的siRNA表達載體siRNA-EGFP-PTZU6+1，雙酶切鑒定及測序鑒定插入序列的正確性，轉(zhuǎn)入EGFP-7721

3、細胞中，RT-PCR、Western blot篩選出更好的siRNA-EGFP-PTZU6+1表達載體。 3.PCR擴增hTERT啟動子的核心片段，將插其入篩選出的siRNA-EGFP-PTZU6+1的U6啟動子中，構(gòu)建靶向EGFP基因的hTERT/U6嵌合啟動子(siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1)的siRNA表達載體，正向和反向插入各一個，測序鑒定其正確性。 4.將siRNA-EGFP-hTERT/U6-

4、PTZU6+1轉(zhuǎn)入EGFP-7721細胞株和EGFP-HELF細胞株中，實時熒光定量PCR和Western blot檢測其抑制EGFP基因的表達效果，體外驗證其有效性和靶向性。 結(jié)果： 1.酶切及測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-PTZU6+1表達載體， RT-PCR、 Western blot結(jié)果表明兩重組質(zhì)粒siRNA-EGFP-PTZU6+1轉(zhuǎn)染EGFP-7721細胞后，EGFP基因表達無統(tǒng)計學差異，但與

5、對照組相比均顯著抑制EGFP基因的表達(P＜0.01)。 2.測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1的表達載體，將其轉(zhuǎn)入EGFP-7721細胞后，RT-PCR結(jié)果表明與對照組相比，反向插入的重組質(zhì)粒顯著抑制EGFP基因的表達(P＜0.01)。 3.實時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果表明，正向和反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EGFP-H

6、ELF細胞與空白質(zhì)粒比較，EGFP基因表達無差異(P＞0.05)。而轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的7721后，僅反向siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重組質(zhì)粒抑制EGFP基因表達(P＜0.01)。siRNA-EGFP-PTZU6+1質(zhì)粒與空白質(zhì)粒組比較，在EGFP-7721和EGFP-HELF細胞株中，EGFP基因的表達均具有統(tǒng)計學差異(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了siRNA-EGFP-hTE