hPXR介導的UGT1A1報告基因模型的建立及應用.pdf

1、本課題建立了hPXR介導的UGT1A1的報告基因模型,并成功地將之應用于體外誘導研究,從多種中藥單體中篩選獲得能通過hPXR途徑誘導UGT1A1的潛在誘導劑,并在UGT1A1的RNA和蛋白質水平上對多種中藥單體的誘導效應進行了驗證。
　　 目的建立基于hPXR的UGT1A1的報告基因模型,研究多種中藥提取物和中藥單體通過hPXR途徑對UGT1A1的潛在誘導能力,并對其進行驗證。
　　 方法以人基因組DNA為模板擴增UGT

2、1A1的遠端啟動子和近端啟動子,連接到含報告基因的pGL3載體上,構建pGL3-PXRE報告基因重組質粒,并與hPXR表達質粒共轉染HepG2細胞,從而建立hPXR介導的UGT1A1的雙熒光素酶報告基因模型。運用該模型考察9種常見中藥和114種中藥單體對hPXR的激活作用,即對UOT1A1的潛在誘導作用,從中篩選出激活作用較高的中藥單體,最后采用real-timePCR和western-blotting的方法從RNA和蛋白質水平上對這些

3、中藥單體的誘導效應進行驗證。
　　 結果將UGT1A1遠端啟動子和近端啟動子片段克隆到含報告基因的pGL3載體上,構建了pGL3-PXRE重組質粒,并與hPXR表達質粒和內參熒光素酶質粒pRL-TK質粒共轉染HepG2細胞,成功構建了基于hPXR的用于研究UGT1A1誘導作用的雙熒光素酶報告基因模型,并考察了9種常見中藥的提取物和114種中藥單體通過hPXR途徑對UGT1A1的潛在誘導效應,篩選得到南五味子、白術和川芎3種提取物

4、,黃酮類單體白楊素和芹菜素,丹參的活性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮,五味子的活性成分五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲和五味子酯甲,銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏酸(17:1),胡椒堿、鉤藤堿、文多靈、吳茱萸次堿、金絲桃素、蒿甲醚和冬凌草甲素這20種中藥單體的誘導效應為陽性對照利福平的70％以上,提示它們可以通過hPXR途徑對UGT1A1的產生不同程度的誘導作用。利用real-timePCR和westem-blottin

5、g的方法對UGT1A1的RNA和蛋白質變化進行考察,驗證了這20種中藥單體中白楊素、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、金絲桃素和吳茱萸次堿這幾種中藥單體可誘導UGT1A1的RNA水平和蛋白質表達。
　　 結論成功建立了基于hPXR的UGT1A1的報告基因模型,為hPXR激活劑的體外篩選提供了一種有效的方法。利用該模型篩選得到多種對UGT1A1有一定誘導作用的中藥單體,并從RNA和蛋白質水平進行了驗證,提示這些化合物與UGT1A1代