精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的影響的研究.pdf

1、目的：通過(guò)制作大鼠背部皮膚深Ⅱ度燒傷模型，給予大鼠模型強(qiáng)飼L-精氨酸(L-arginine L-Arg)，并在燒傷創(chuàng)面局部聯(lián)合應(yīng)用纖維連接蛋白(fibronectin FN)，干預(yù)創(chuàng)面愈合過(guò)程，從而觀察L-精氨酸與纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用對(duì)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合速度和愈合質(zhì)量的影響；并通過(guò)免疫組織化學(xué)方法揭示燒傷愈合過(guò)程中一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)規(guī)律；通過(guò)光鏡觀察愈合期間不同階段的成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原纖維的含量變化；通過(guò)生物化學(xué)方法檢測(cè)肉芽

2、組織中羥脯氨酸含量；通過(guò)實(shí)驗(yàn)前后對(duì)比，觀察創(chuàng)面的愈合狀況。研究L-精氨酸與纖維連接蛋白對(duì)深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面愈合的影響，為臨床探索促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的有效方法，并為進(jìn)一步深化燒傷創(chuàng)面愈合修復(fù)的臨床研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性健康Wistar大鼠60只，稱(chēng)重，編號(hào)。2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：將大鼠隨機(jī)分為4組：即對(duì)照組(0.9％生理鹽水)、實(shí)驗(yàn)A組(L-Arg 400mg/kg/d聯(lián)合0.5mg/ml的FN0.05ml)、B組(L

3、-Arg 400mg/kg/d)、C組(0.5mg/ml的：FN0.05ml)。每組15只。3、深Ⅱ度燒傷模型制備方法：大鼠用3％戊巴比妥腹腔注射麻醉(35mg/kg)，背部剪毛，8％硫化鈉脫毛，溫清水清洗，拭干。飼養(yǎng)24小時(shí)后用同法戊巴比妥腹腔注射麻醉成功后，將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。在背部脊柱兩側(cè)旁開(kāi)1cm，頭尾兩端平行于脊柱各標(biāo)記一個(gè)邊長(zhǎng)為1.5cm，面積為2.25cm2的正方形預(yù)處理標(biāo)記線。用相同面積的煤油紗布覆于背部的標(biāo)記線

4、內(nèi)，用濕紗布保護(hù)周?chē)つw后，點(diǎn)燃煤油紗布并使之燃燒10秒后用生理鹽水紗布蓋滅，形成4個(gè)正方形深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面(病理證實(shí)，圖3)。取0.5mg/ml的FN0.05ml注射于實(shí)驗(yàn)A組和C組每個(gè)創(chuàng)面筋膜層及創(chuàng)面皮下組織內(nèi)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)B組給予0.9％生理鹽水輔料包扎。待大鼠清醒后，按照400mg/kg/d計(jì)算并分別給與實(shí)驗(yàn)A組和B組L-Arg灌胃。隔日換藥一次(處死動(dòng)物當(dāng)天不換藥)。實(shí)驗(yàn)A組和C組每天每個(gè)創(chuàng)面注射0.5mg/ml的FN0.05m

5、l，直至動(dòng)物處死。4、取材：每組動(dòng)物分為5組，每組3只，分別在術(shù)后3、5、7、14、21天切取原燒傷范圍內(nèi)皮膚組織全層，隨機(jī)將一塊組織固定在4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋，切片，分別行常規(guī)HE染色、Masson染色及免疫組化染色。剩余的組織于-20℃冷凍保存，行組織化學(xué)檢測(cè)。5、觀察指標(biāo)：(1)大體觀察。(2)成纖維細(xì)胞數(shù)密度(numerical density on area,NA)：400倍光鏡下觀察HE染色切片，在肉芽組織中央淺部、

6、中央深部、兩側(cè)部各隨機(jī)選取10個(gè)矩形視野(0.0052mm2/視野)，目測(cè)計(jì)數(shù)并計(jì)算切片內(nèi)單位面積成纖維細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果取均數(shù)。(3)膠原纖維面密度(area density on area,AA)：Masson染色組織切片，在肉芽組織中央淺部、中央深部、兩側(cè)部個(gè)隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)輔助病理圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算綠染的膠原纖維的面密度，結(jié)果取均數(shù)。(4)按照羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定肉芽組織羥脯氨酸含量。(5)對(duì)免疫組化染色切片

7、，光鏡觀察NOS2分布部位和著色深淺程度。采用數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞比率。6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS12.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以X±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：1、形態(tài)學(xué)觀察：對(duì)照組于創(chuàng)傷后20～21天可以基本愈合；實(shí)驗(yàn)A組肉芽組織生長(zhǎng)良好，愈合時(shí)間較對(duì)照組提前3～4天。實(shí)驗(yàn)B組、C組愈合情況良好，較對(duì)照組提前1～2天。2、光鏡觀察：實(shí)驗(yàn)A組

8、在燒傷后3天，5天，7天比對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)B組、C組均有較多的毛細(xì)血管形成，燒傷后14天，21天成纖維細(xì)胞，膠原纖維排列整齊；實(shí)驗(yàn)B組、C組在燒傷后3天，5天，7天雖也有較多的毛細(xì)血管形成，但是較實(shí)驗(yàn)A組少，且炎性反應(yīng)較實(shí)驗(yàn)A組嚴(yán)重。3、成纖維細(xì)胞數(shù)密度(NA)：實(shí)驗(yàn)A組、B組、C組在燒傷后3、5、7天NA均高于對(duì)照組水平(P＜0.05)，而在燒傷后14、21天均低于對(duì)照組(P＜0.05)：而實(shí)驗(yàn)A組較B、C組更為明顯(P＜0.01)。4、

9、膠原纖維面密度(AA)：四組均呈持續(xù)性增加的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)A組在所有時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組(P＜0.01)；B、C組在所有時(shí)間點(diǎn)亦高于對(duì)照組(P＜0.05)。5、羥脯氨酸含量：對(duì)照組羥脯氨酸含量從創(chuàng)傷后第3天到第14天進(jìn)行性增加；從第14天到第21天緩慢下降。實(shí)驗(yàn)A組在燒傷后各時(shí)間點(diǎn)羥脯氨酸含量均高于對(duì)照組(P＜0.01)；實(shí)驗(yàn)B、C組在燒傷后各時(shí)間點(diǎn)羥脯氨酸含量亦高于對(duì)照組(P＜0.05)。6、NOS2陽(yáng)性細(xì)胞比率：對(duì)照組燒傷后3天細(xì)胞陽(yáng)性染

10、色強(qiáng)度增強(qiáng)并達(dá)到高峰，3～7天細(xì)胞中的NOS2在細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)相對(duì)維持穩(wěn)定水平，燒傷后14天細(xì)胞中的陽(yáng)性表達(dá)再次達(dá)到一個(gè)高峰，其后陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱。而實(shí)驗(yàn)A、B、C三組燒傷后3天開(kāi)始細(xì)胞陽(yáng)性染色增強(qiáng)，到第14天時(shí)達(dá)到高峰，其中以A組陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)(A組P＜0.01，B、C組P＜0.05)，其后陽(yáng)性表達(dá)逐漸減弱。 結(jié)論：在燒傷創(chuàng)面的愈合過(guò)程中單獨(dú)使用L-精氨酸或纖維連接蛋白可以促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合，而局部外用纖維連接蛋白的同時(shí)聯(lián)合全