重組人卵泡刺激素在昆蟲細胞和巴斯德畢赤酵母細胞中的表達.pdf

1、人卵泡刺激素(human follicle stimulating hormone,hFSH)是糖蛋白家族成員之一,該家族除了FSH外還包括黃體生成素(luteinizing hormone,LH),促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone,TSH),絨毛膜促性腺激素(chorionicgonadotrophin hormone,CG),它們都是異二聚體,包括非共價結合的α亞基和β亞基.α亞基在上述每一種激素中

2、是相同的,是由同一基因編碼的,而β亞基對于每一種激素是特異的,決定其抗原性和生物活性.hFSH在生殖過程中發(fā)揮重要作用,因其刺激排卵和生精的作用,FSH目前在臨床上廣泛應用于治療不孕不育.該研究的主要目的是探索一種生產(chǎn)成本較低,活性更好的表達重組人卵泡刺激素的表達系統(tǒng)和方法.該論文的工作是進行人卵泡刺激素在昆蟲細胞和巴斯德畢赤酵母細胞中的表達.首先我們是在昆蟲細胞中表達重組人卵泡刺激素.我們以重疊PCR的方法,從人染色體DNA中擴增出h

3、FSH β亞基的cDNA的編碼區(qū),將其克隆入核型多角體病毒(AcNPV)非融合蛋白基因表達載體pVLl393,得到了表達載體pVLl393-hFSH β.將其與BaculoGoldTM線形桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細胞SF9,經(jīng)多次擴增后獲得高滴度的重組病毒AcNPV-hFSH β,然后將重組病毒感染昆蟲細胞,得到在胞漿中表達的hFSH β亞基,Western blot顯示分子量為2lkDa.最后以重組病毒AcNPV-hFSH β與AcN

4、PV-hCG α一同感染昆蟲細胞,得到具有分泌性的重組hFSH異源二聚體,Western blot顯示分子量為33kDa.接著我們在巴斯德畢赤酵母中表達單鏈重組人卵泡刺激素.hFSH的兩個亞基以非共價健相連,這種結合很不牢固,常常由于一些原因解離成單鏈,從而影響其活性.我們將兩個亞基以共價方式結合起來形成單鏈結構,為了不影響其空間結構和活性,分別設計了兩種連接物(CTP linker和GS linker),在巴斯德畢赤酵母中進行了單鏈重

5、組人卵泡刺激素的表達.我們同樣是利用重疊PCR的方法分別獲得編碼hFSHβ-CTP37-hCGα的cDNA和hFSHβ-GSlinker-hCGα的cDNA,將它們克隆入畢赤酵母的表達載體pPIC9K中,分別得到表達載體pPIC9K/hFSHβ-CTP37-hCGα和pPIC9K/hFSHβ-GSlinker-hCGα.然后將這兩個表達載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母細胞GSll5,得到了可以分泌到培養(yǎng)液中的單鏈重組人卵泡刺激素FSHCTP和FSHGS