siRNA表達載體介導的RNA干擾抑制新型隱球菌cap10基因的表達.pdf

1、目的：構建針對新型隱球菌cap10基因的siRNA表達載體質(zhì)粒，并轉入新型隱球菌中，評價siRNA表達載體質(zhì)粒對新型隱球菌(Cryptococcus neoformans，CN)莢膜相關蛋白(capsule associated protein，CAP)基因cap10表達的抑制效應，為新型隱球菌感染的治療奠定基礎。 方法：以cap10基因為靶基因，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的cap10基因核苷酸序列，按照干擾模板設計原則，應用

2、網(wǎng)絡在線軟件確定一個針對cap10 mRNA的RNAi(RNAinteference，RNAi)靶點，設計1對可形成發(fā)夾結構的核苷酸序列，將其復性后插入載體質(zhì)粒psilencer4.1-CMV neo，構建重組體。用LiAc化學法將重組質(zhì)粒轉染新型隱球菌細胞，確定G418篩選的濃度并篩選成功轉染的陽性菌株。構建cap10基因表達熒光定量PCR檢測體系：比對新型隱球菌5種血清型(A、B、C、D、AD)的cap10基因序列，找出同源序列來設

3、計引物和探針，并將其PCR擴增基因片段克隆到pGEM-T Easy載體上，構建質(zhì)粒標準品；建立FQ-PCR體系，優(yōu)化反應條件，建立標準曲線，進行敏感性、特異性、重復性試驗；將各組新型隱球菌培養(yǎng)后抽提總RNA，利用熒光定量檢測體系分別測定各實驗組cap10基因的表達情況。取培養(yǎng)后的新型隱球菌與巨噬細胞標準株J774A.1進行共孵育，經(jīng)過PBS沖洗和甲醇固定，用吉姆薩染液對細胞進行染色，在顯微鏡下觀察，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。用SPSS13.

4、0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計學分析。 結果： 1.靶向cap10基因的siRNA表達載體質(zhì)粒的測序結果與設計序列一致； 2.抽提新型隱球菌陽性克隆中的質(zhì)粒，序列測序結果與設計序列完全相同。 3.cap10基因表達的熒光定量檢測體系檢測敏感度為104copies/μl，線性范圍為104～1010 copies/μl，批內(nèi)CV為0.31％，批間CV為2.73％。 4.pS4.1-siRC-1轉染干擾組新型

5、隱球菌的cap10基因表達平均拷貝數(shù)為175534.62copies/μl，明顯低于對照實驗組(321995.52copies/μl)和空白實驗組(562931.66copies/μl)(均P<0.05)，平均抑制率為30.58％。 5.新型隱球菌與巨噬細胞株J774A.1共孵育后，pS4.1-siRC-1轉染干擾組平均吞噬指數(shù)為0.128971212，吞噬率為10.06％，明顯均高于對照實驗組(0.078898104，6.57