VEGF與RUNX2聯(lián)合基因修飾對BMSCs分化的影響.pdf

1、研究目的：研究血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與核心結(jié)合因子al(RUNX2)共同轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對BMSCs增殖活性成骨分化的影響,探索VEGF與RUNX2相互作用及機(jī)制,為VEGF與RUNX2雙基因強(qiáng)化的組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法：根據(jù)Gene Bank中VEGF、RLINX2的基因序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的引物；應(yīng)用Trizol-步法從成骨肉瘤細(xì)胞株MG63中抽提總RNA;應(yīng)用RT-PC

2、R技術(shù)擴(kuò)增目的基因VEGF和RUNX2,并進(jìn)行序列測定；應(yīng)用AdEasy腺病毒系統(tǒng)構(gòu)建目的基因重組腺病毒Ad-VEGF、Ad-RUNX2及Ad-VEGF-RUNX2,并進(jìn)行酶切鑒定及滴度測定；從新西蘭大白兔脛骨結(jié)節(jié)內(nèi)側(cè)穿刺抽取骨髓,密度梯度離心后,接種至含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,于5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞長至80％～90％匯合時(shí),胰酶EDTA消化傳代；將第三代BMSCs接種至24孔板,分為5組,分別為Ad-V

3、EGF轉(zhuǎn)染組、Ad-RUNX2轉(zhuǎn)染組、Ad-VEGF-RUNX2轉(zhuǎn)染組、Ad-GFP轉(zhuǎn)染組及未轉(zhuǎn)染組；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及Weston Blot技術(shù)檢測5組BMSCs中目的基因VEGF及RUNX2的表達(dá)；應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別檢測5組細(xì)胞的增殖活性；收集5組細(xì)胞,重懸于100ml PBS中反復(fù)凍溶3次,并輔以超聲破碎,制成待檢樣本,經(jīng)過BCA蛋白定量后進(jìn)行堿性磷酸酶活性測定；收集培養(yǎng)第7d的細(xì)胞培養(yǎng)上清,凍干后以競爭性結(jié)合放射免疫法檢測樣

4、本中骨鈣素含量；檢測結(jié)果應(yīng)用SPSS11.5軟件進(jìn)行處理,分析VEGF與RUNX2基因轉(zhuǎn)染對于BMSCs增殖及分化的影響。 結(jié)果：從MG63中分成功離出VEGF及RUNX2基因,測序結(jié)果與GeneBank中的相應(yīng)的基因序列一致；利用AdEasy腺病毒系統(tǒng)成功構(gòu)建重組目的基因的腺病毒Ad-VEGF、Ad-RUNX2及Ad-VEGF-RUNX2;應(yīng)用密度梯度離心法,從兔骨髓中成功分離出BMSCs細(xì)胞,應(yīng)用EnVision免疫組化檢測

5、到CD34、CD44、CD45、CD90、CD11b和Laminine等BMSCs表面標(biāo)志性抗原的表達(dá)；重組腺病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后,應(yīng)用RT-PCR技術(shù)及Weston Blot技術(shù),分別從基因和蛋白水平檢測到VEGF及RUNX2在BMSCs中的表達(dá)；各組BMSCs轉(zhuǎn)染目的基因后,細(xì)胞的增殖活性、堿性磷酸酶活性及培養(yǎng)上清中骨鈣素含量均明顯升高,其中以Ad-VEGF-RUNX2轉(zhuǎn)染組升高最為明顯,Ad-RUNX2次之。 結(jié)論： Ad