腸道病毒71型感染人腦微血管內皮細胞的機制研究.pdf

1、一、研究背景和目的：
　　 腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的成員，歸屬于人類腸道病毒A。目前已知EV71的感染可以導致手足口病、皰疹性咽峽炎、無菌性腦膜炎、腦炎和脊髓灰質炎樣的麻痹性疾病等多種與神經系統(tǒng)相關的疾病，嚴重病理癥狀通常在兒童中發(fā)生。自1974年Schmidt等人首次報道從美國加利福尼亞暴發(fā)的表現(xiàn)為神經系統(tǒng)癥狀疾病(1969～1973年)的患者中分離到EV71，隨后

2、，世界上許多國家相繼報道了EV71病毒在不同地區(qū)的流行情況，EV71病毒已在世界范圍內引起多次暴發(fā)與流行。盡管EV71的基因組和生命周期相似于小核糖核酸病毒科的其它成員，但相應引起的病理癥狀明顯不同;至今尚無特異性的治療方法及有效的針對性的疫苗預防EV71的感染，因此明確EV71的致病機制對控制嬰幼兒手足口病的流行與有效治療該疾病具有十分重要的意義。
　　 相關研究證實在EV71患者中樞神經系統(tǒng)(central nervous

3、system，CNS)的腦干、神經元等部位都已檢測到EV71基因及抗原的存在，證明EV71能進入CNS。目前，對于EV71進入CNS的途徑有兩種理論，如同脊髓灰質炎:病毒入血穿血腦屏障或通過末梢神經沿逆軸突運輸感染CNS。有關研究證實新生小鼠口服EV71后，早期可引起持續(xù)性病毒血癥和血腦脊液屏障通透性增加，推測EV71可通過血運途徑傳播，但腦組織低水平的病毒數(shù)量提示血源性途徑并非累及CNS的主要途徑，所以EV71穿血腦屏障(blood

4、brain barrier,BBB)機制還未明確。眾所周知，BBB是循環(huán)和CNS之間一道主要的屏障，它限制著不同物質在兩個部位之間的自由運輸，對維持CNS的體內平衡起著一個關鍵的角色，故明確EV71穿BBB的機制對于防治EV71所致的CNS感染有重要意義，這亦是我們想探討的內容。我們知道，病毒感染過程的第一步是病毒通過與位于細胞表面的特異性受體結合而吸附于被感染的細胞的表面，然后利用細胞的內吞作用進入細胞或將病毒的核酸釋放進細胞。所以我

5、們推測構成BBB的主要成分之一內皮細胞可能是EV71的易感細胞，EV71與其結合而導致BBB結構改變和功能障礙，從而感染中樞神經系統(tǒng)。本研究采用分離鑒定的來自于重癥手足口病患者的EV71毒株感染HBMEC，形態(tài)學觀察HBMEC的細胞病變、透射電鏡檢測HBMEC中EV71的超微結構與Real-Time PCR方法以檢測HBMEC細胞培養(yǎng)上清液中EV71拷貝數(shù)變化情況，以探討EV71是否能感染HBMEC并能在其中復制;且進一步檢測EV71是

6、否可以誘導HBMEC細胞骨架的改變并誘導其凋亡。最后，因為病毒成功實現(xiàn)對宿主細胞的感染并在細胞內復制需要克服細胞對病毒感染產生的各種免疫防衛(wèi)反應，阻斷或影響宿主細胞的正常循環(huán)機制，利用宿主細胞的物質和能量合成病毒自身物質，這種相互作用最終會導致宿主細胞蛋白表達模式的改變，這種改變影響著宿主細胞的正常生理功能，決定和反映著病毒感染致病的進程和結果。為了研究EV71感染HBMEC后宿主細胞蛋白表達模式的改變，為揭示病毒與HBMEC的相互作用

7、機制、病毒的分子致病機制、尋找病毒的作用靶標等研究提供有意義的信息。本研究采用2-D技術分析HBMEC感染EV71后1h、16h、24h時間點與正常HBMEC的培養(yǎng)上清和細胞內的蛋白表達差異點，然后對差異蛋白點進行酶切，提取肽片段，最后用MALDI-TOF/TOF-MS質譜技術獲得PMFMSMS圖，并利用Internet上的蛋白質數(shù)據庫對肽質量進行檢索，尋找具有相似肽質量指紋圖的蛋白質，鑒定了差異率＞2.5的蛋白。并采用免疫印跡方法進一

8、步對其中波形蛋白(vimentin)差異蛋白的變化進行了驗證。
　　 二、方法：
　　 1、分離與鑒定來自于臨床診斷為重癥手足口病患者的EV71毒株
　　 采用來自于臨床診斷為重癥手足口病患者的糞便或肛拭子，經腸道病毒通用型引物及EV71特異性引物檢測初步診斷為EV71感染。再經RD細胞分離增殖病毒，并采用EV71(226bp)引物與EV71VP1全基因序列(1086bp)引物進行RT-PCR再次鑒定，并測序與b

9、last比對證實。
　　 2、EV71對人腦微血管內皮細胞的感染
　　 采用已分離鑒定的EV71毒株感染HBMEC并設置空白對照組:觀察HBMEC感染EV71后不同時間點的形態(tài)改變，并采用兔抗-EV71多克隆抗體檢測HBMEC內EV71抗原的存在，透射電鏡直接觀察EV71作用HBMEC內是否存在EV71病毒顆粒，并采用(226bp)EV71特異性引物對EV71感染HBMEC和RD細胞不同時間點的培養(yǎng)上清液行定量Real-

10、Time PCR，以檢測HBMEC和RD細胞感染EV71不同時間點分泌的EV71拷貝數(shù)變化以得出EV71在HBMEC的復制趨勢圖。
　　 3、采用JC-1線粒體早期凋亡試劑盒檢測EV71感染HBMEC8h時能否導致HBMEC的早期線粒體膜電位降低;采用Annexin-VFITC/PIkit檢測EV71能否導致HBMEC的凋亡;采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色以探討EV71感染HBMEC能否導致HBMEC細胞骨架的重排。
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11、、EV71感染HBMEC差異蛋白質組學的研究
　　 采用分離EV71毒株在不同時間點感染HBMEC，收集裂解細胞，采用Bradford染色液定量蛋白，一向等電聚焦，二向聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，并進行銀染和考染，銀染膠用來分析、考染膠進行質譜鑒定。采用ImageScanner掃描儀對膠進行掃描，凝膠圖像用ImageMaster7.0進行分析。設置差異點倍數(shù)為2.5倍，對差異點進行確認，剔除單塊膠個別豐度過高或低的點

12、。挖取差異點進行酶切，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜和蛋白信息數(shù)據庫建立差異蛋白質譜。并對鑒定出的蛋白進行功能分析，并采用免疫印跡技術進一步驗證鑒定出的差異蛋白vimentin在HBMEC感染EV71不同時間點及正常HBMEC中的表達。
　　 三、統(tǒng)計分析：
　　 數(shù)據均用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。不同時間點的凋亡率以及HBMEC與RD細胞兩組間的EV71拷貝數(shù)比較采用兩個重復測量因素的方

13、差分析，線粒體凋亡采用獨立樣本t檢驗分析。P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義，相關統(tǒng)計圖采用Excel或Origin繪圖軟件制作。
　　 四、結果：
　　 1、分離鑒定出一株重癥EV71毒株。
　　 2、從形態(tài)學觀察，EV71可以導致HBMEC的細胞病變，隨著感染時間延長，病變程度愈嚴重;通過透射電鏡可以發(fā)現(xiàn)EV71處理HBMEC內存在直徑20～30nm的病毒顆粒;采用抗EV71多克隆抗體進一步證實EV71組HBMEC

14、內EV71抗原的存在;而采用EV71特異性引物行實時熒光定量PCR表明EV71能感染HBMEC，并且可在HBMEC內復制，其拷貝數(shù)在感染第3天達到最高峰，其復制最高峰出現(xiàn)時間比EV71易感細胞RD細胞早，但最終拷貝數(shù)低于RD細胞(P＜0.01);通過采用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色證實EV71感染HBMEC能導致HBMEC細胞骨架的重排;另外采用JC-1試劑盒證實EV71能在8h誘導HBMEC早期凋亡;采用annexin-VFITC/PI凋亡檢

15、測試劑盒檢測到EV71能誘導HBMEC的凋亡，而隨著感染時間的延長，主要以細胞壞死為主，感染時間對EV71感染所誘導的凋亡和壞死有顯著影響(P＜0.01)。
　　 3、通過雙向凝膠電泳與質譜鑒定，初步鑒定了HBMEC感染EV71在0、1、16、24h的28個差異表達蛋白。
　　 4、通過免疫印跡對EV71感染HBMEC與HBMEC的差異表達蛋白進一步驗證，證實EV71感染HBMEC可以誘導Vimentin的表達下調，與蛋

16、白質組學結果一致。
　　 五、結論：
　　 1、我們分離鑒定了來自于重癥手足口病患者的EV71野生毒株，體外模擬EV71感染HBMEC模型。
　　 2、通過形態(tài)學觀察及免疫熒光和透射電鏡方法證實EV71能感染HBMEC;采用Real-timePCR方法進一步證實EV71能在HBMEC內復制，這說明HBMEC是EV71的易感細胞，但復制效率低于RD細胞。HBMEC上可能存在EV71的特異性受體，EV71與BBB內皮

17、細胞上特異性受體結合進而通過內吞作用進入細胞里面復制，導致其形態(tài)與功能改變而穿BBB入腦。
　　 3、采用JC-1線粒體凋亡檢測試劑盒證實EV71感染HBMEC能誘導其線粒體膜電位降低，并且采用Annex-VFITC/PI染色方法證實EV71能誘導HBMEC的凋亡，隨著感染時間延長，細胞主要以壞死為主。說明EV71可誘導HBMEC線粒體的凋亡，而線粒體結構和功能障礙是各種刺激因素誘導細胞凋亡的中心事件，并由此導致線粒體內凋亡誘發(fā)

18、因子的釋放，參與對細胞凋亡的調控，而引起了HBMEC的凋亡。
　　 4、EV71感染HBMEC能導致HBMEC細胞微絲結構的重排，而微絲結構的改變可能對于病毒的復制和活化也起到一定的輔助作用。
　　 5、蛋白質組學研究共發(fā)現(xiàn)EV71感染HBMEC進程中28個差異表達蛋白，按功能分為9類。結合差異譜中表達量發(fā)生改變的蛋白的功能與EV71感染和未感染HBMEC蛋白表達量變化分析，發(fā)現(xiàn)了一些在感染中有重要意義的分子靶標。