高密度脂蛋白對(duì)骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、遷移、旁分泌和抗凋亡能力的影響及機(jī)制研究.pdf

1、引言：
　　缺血性心臟病是高發(fā)病率、高死亡率的的疾病之一，特別是急性心肌梗死發(fā)生以后，死亡的心肌不可再生，遠(yuǎn)期發(fā)生心肌重構(gòu)、甚至心力衰竭。干細(xì)胞移植給缺血性心臟病的治療帶來(lái)了曙光，科學(xué)家們努力尋找可以用于治療心肌梗死的干細(xì)胞。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)早在40多年以前就被發(fā)現(xiàn)、分離，并用于移植治療心肌梗死。MSCs作為移植治療的“種子細(xì)胞”，具有容易獲得、擴(kuò)增簡(jiǎn)單、可多向分化和存在獨(dú)特的免疫耐受性等優(yōu)點(diǎn)，因而在細(xì)胞移植修復(fù)

2、心肌的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床治療中得到了廣泛的研究。
　　MSCs移植治療缺血心肌的療效有賴于其移植后的存活能力。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死的家豬模型中，一次移植6×107只細(xì)胞入梗死心肌周邊，能獲得的心功能改善也非常有限。還有學(xué)者研究報(bào)道，MSCs在移植后4天內(nèi)就發(fā)生明顯的凋亡，最終能存活的僅有0.44％。因此，如何提高M(jìn)SCs抵御缺血缺氧和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的能力、提高其在移植后心肌局部的存活能力將有助于大大提高M(jìn)SCs移植治療急性心

3、肌梗死的臨床療效。
　　血漿高密度脂蛋白(HDL)這一心血管疾病的保護(hù)性因子逐漸為人們所認(rèn)識(shí)。大多數(shù)研究認(rèn)為，HDL之所以對(duì)心血管疾病有益，主要原因在于它含有一個(gè)重要的脂蛋白——apoA-Ⅰ，具有膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)功能。然而，新近的研究發(fā)現(xiàn)，HDL的功能遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止人們所發(fā)現(xiàn)的這些。因?yàn)樵贖DL的組成成分中，只有三分之一與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，而其余部分卻和抑制蛋白酶活性、補(bǔ)體調(diào)節(jié)以及應(yīng)激調(diào)控有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)提示我們，HDL可能存在著廣泛的功能

4、，比如抗炎、抗氧化和抗凋亡等特性; HDL的作用可能不只局限于在心血管疾病或者內(nèi)分泌代謝疾病領(lǐng)域里所認(rèn)識(shí)的這些，而是參與了與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡壞死有關(guān)的所有病理生理過(guò)程。
　　因此，我們猜想:是否血漿較高的HDL水平可以影響MSCs的某些生物學(xué)特性，進(jìn)而增強(qiáng)MSCs的心肌修復(fù)能力？是否HDL可以促進(jìn)MSCs遷移、增殖？或者可以提高M(jìn)SCs抗凋亡的能力？本研究將著重考察HDL對(duì)MSCs生物學(xué)特性的影響，并用經(jīng)HDL預(yù)處理的

5、MSCs移植治療急性心肌梗死的動(dòng)物模型，觀察遠(yuǎn)期心室重構(gòu)和心功能的情況，嘗試從改善MSCs特性、促進(jìn)心肌修復(fù)的嶄新視角闡明HDL對(duì)缺血性心臟病預(yù)后的影響，為冠心病患者的血脂管理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論參考。
　　第一部分高密度脂蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移能力影響及機(jī)制研究
　　目的：觀察高密度脂蛋白(HDL)對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的增殖和遷移能力的影響，并探討可能的機(jī)制。
　　方法：大鼠骨髓來(lái)源的MSCs在不同

6、濃度的HDL中孵育不同的時(shí)間，用MTT和BrdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖率，用劃痕試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移率;Western-blot檢測(cè)p21的表達(dá)和Akt, ERK1/2磷酸化水平;抑制信號(hào)通路活性后觀察HDL促M(fèi)SCs作用可能的信號(hào)通路;并以RNA干擾的方法觀察清道夫受體B族Ⅰ型(SR-BⅠ)在HDL對(duì)細(xì)胞增殖活性影響中的作用。
　　結(jié)果：HDL對(duì)MSCs的遷移活性沒(méi)有影響，但可以呈時(shí)間和濃度依賴性地促進(jìn)MSCs的增殖，并伴隨著MAPK/ER

7、K，PI3K/Akt通路的活化和p21蛋白的表達(dá)下調(diào)。當(dāng)先給予MAPK/ERK通路抑制劑U0126預(yù)處理后再用HDL孵育時(shí)，p21的表達(dá)比未經(jīng)預(yù)處理組明顯增高（1.68±0.17 vs.0.76±0.15，p＜0.05）;同樣地，當(dāng)先給予PI3K/Akt通路抑制劑LY294002預(yù)處理時(shí)，p21的表達(dá)也比未經(jīng)預(yù)處理時(shí)明顯增高（1.03±0.16 vs.0.691±0.13，p＜0.05）。HDL的孵育上調(diào)了SR-BⅠ的表達(dá);經(jīng)SR-BⅠ

8、siRNA干擾后，MSCs在與HDL孵育時(shí)的增殖作用與未孵育組相比沒(méi)有顯著差別（1.08±0.14 vs.1.08±0.15，p＞0.05）;而在經(jīng)mock siRNA干擾的MSCs，HDL的促增殖作用比未經(jīng)HDL孵育時(shí)顯著升高（1.57±0.23 vs.0.98±0.16，p＜0.05）。
　　結(jié)論：HDL可呈時(shí)間和濃度依賴性地促進(jìn)MSCs的增殖;SR-BⅠ是其作用的受體，PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2是其發(fā)揮調(diào)控的部

9、分通路。
　　第二部分高密度脂蛋白影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌能力并保護(hù)心肌細(xì)胞減少缺氧誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究
　　目的：觀察HDL對(duì)MSCs的旁分泌能力的影響，并研究所分泌的因子是否對(duì)心肌細(xì)胞抵御缺氧誘導(dǎo)的凋亡有作用。
　　方法：骨髓來(lái)源的MSCs經(jīng)不同濃度的HDL孵育不同的時(shí)間后，以實(shí)時(shí)定量PCR的方法評(píng)價(jià)VEGF, bFGF, HGF和TGF-β2等活性因子mRNA的表達(dá)情況，以ELISA的方法評(píng)價(jià)培養(yǎng)基上清活性因子的

10、含量。用以下各種條件培養(yǎng)基培養(yǎng)缺氧條件下的新生大鼠心肌細(xì)胞:1）(MSCs+HDL)組:HDL(100μg/ml)孵育培養(yǎng)MSCs的培養(yǎng)液上清，超濾后獲得的條件培養(yǎng)基;2）MSCs組:MSCs的培養(yǎng)液上清，超濾后獲得的條件培養(yǎng)基;3）HDL組:含HDL(100μg/ml)的培養(yǎng)基;4）(Positive Control)組:單純培養(yǎng)基。用TUNEL檢測(cè)以上4組心肌細(xì)胞在缺氧條件下的凋亡水平，用Western-blot檢測(cè)4組心肌細(xì)胞在缺

11、氧條件下的bcl-2和bax的表達(dá)差異。并用siRNA的方法下調(diào)MSCs的TGF-β2表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)分析HDL預(yù)處理siRNA后的MSCs的培養(yǎng)液上清（siRNA組）對(duì)心肌細(xì)胞耐受缺氧誘導(dǎo)凋亡的能力有無(wú)影響。
　　結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR和ELISA結(jié)果都發(fā)現(xiàn)HDL可以呈時(shí)間和濃度依賴性地促進(jìn)MSCs分泌TGF-β2。TUNEL提示(MSCs+HDL)組的細(xì)胞凋亡率比(PositiveControl)組，HDL組和MSCs組都明顯

12、降低[(10.23±5.68)％vs.(28.36±4.98)％，vs.(16.38±5.38)％，vs(17.82±6.24)％，p均＜0.05]; Western-blot提示(MSCs+HDL)組的bcl-2/bax水平比(Positive Control)組，HDL組和MSCs組明顯升高[(0.846±0.16) vs.(0.156±0.03)，vs.(0.411±0.10)，vs.(0.346±0.08)，p均＜0.05].而

13、當(dāng)下調(diào)TGF-β2表達(dá)后，siRNA組的凋亡率則明顯高于(MSCs+HDL)組[(10.28±1.33)％vs.(5.34±0.67)％,p＜0.05].
　　結(jié)論：高密度脂蛋白呈時(shí)間和濃度依賴性地促進(jìn)TGF-β2的分泌，該因子可以保護(hù)心肌細(xì)胞抵御缺氧誘導(dǎo)的凋亡。
　　第三部分高密度脂蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗凋亡能力的影響及機(jī)制研究
　　目的：探討高密度脂蛋白對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡能力的影響，并探討其可能

14、的機(jī)制。
　　方法：用過(guò)氧化氫(H2O2)干預(yù)的方式模擬氧化應(yīng)激建立體外模型:用不同濃度的H2O2(0，20μM，50μM，100μM和200μM)干預(yù)1小時(shí)后，用Hochest33342檢測(cè)凋亡以確定損傷模型的干預(yù)濃度。之后MSCs隨機(jī)分為4組:1)(H2O2+HDL)組:用HDL（100μg/ml）預(yù)處理24小時(shí)后，再用H2O2（100μM）干預(yù)1小時(shí);2) HDL組:僅用HDL孵育，但不接受H2O2損傷干預(yù);3）H2O2組:

15、未用HDL預(yù)處理，直接加用H2O2干預(yù);4）Control組:不接受HDL預(yù)處理，也未加用H2O2損傷。用活性氧探針(ROS)檢測(cè)MSCs胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平、用TUNEL比較MSCs凋亡程度、用Western-blot檢測(cè)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。用Bio-Plex懸液芯片篩選HDL影響MSCs抗凋亡能力的可能信號(hào)通路。
　　結(jié)果：100μM以上的H2O2可明顯誘導(dǎo)MSCs凋亡。（H2O2+HDL）組胞內(nèi)的ROS積聚較H2O2組明顯

16、減少（1.56±0.38 vs.5.68±0.56，p＜0.05），細(xì)胞凋亡水平顯著降低[(28.77±6.91)％vs.(47.37±7.53)％，p＜0.05];胞內(nèi)bcl-2和bax蛋白表達(dá)水平明顯升高（1.36±0.44 vs.0.44±0.17，p＜0.05）。懸液芯片檢測(cè)結(jié)果顯示，和H2O2組相比，(H2O2+HDL)組的MAPK/JNK，MAPK/P38信號(hào)通路的磷酸化水平?jīng)]有顯著差異，分別為[MAPK/JNK:（70.5

17、6±5.91）vs.（51.03±4.56），p＞0.05]，[MAPK/P38:（10.70±3.46） vs.（3.34±1.28），p＞0.05];而MAPK/ERK信號(hào)通路的活化則有明顯的減輕[（51.03±5.73）vs.（17.73±3.22），p＜0.05]。
　　結(jié)論：HDL預(yù)處理可以提高M(jìn)SCs抵御氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，可能通過(guò)MAPK/ERK信號(hào)通路參與調(diào)控。
　　第四部分高密度脂蛋白預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)

18、干細(xì)胞移植治療大鼠急性心肌梗死實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：評(píng)價(jià)以HDL預(yù)處理的MSCs移植治療急性心肌梗死大鼠的療效，觀察遠(yuǎn)期心功能變化。
　　方法：從雌性SD大鼠分離、獲取MSCs后傳代培養(yǎng)。建立雄性大鼠急性心肌梗死動(dòng)物模型，以綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)染標(biāo)記的MSCs行心肌內(nèi)注射移植。其中移植HDL預(yù)處理的MSCs為(MSCs+HDL)組，移植未作預(yù)處理的MSCs為MSCs組，輸注PBS為Control組。當(dāng)觀察MSCs存活率時(shí)，

19、于移植后4天處死大鼠，取材后計(jì)數(shù)局部心肌GFP+細(xì)胞的數(shù)量，以實(shí)時(shí)定量PCR法分析sry基因在局部心肌的表達(dá)水平。當(dāng)觀察MSCs移植療效時(shí)，于移植后4周先用小動(dòng)物心超測(cè)量心室腔徑和左室射血分?jǐn)?shù)，后處死大鼠，取材以Masson染色計(jì)算心肌梗死面積，以CD31免疫組化檢測(cè)局部毛細(xì)血管密度。
　　結(jié)果：和MSCs組相比，(MSCs+HDL)組可見(jiàn)到梗死周邊有更多的GFP+細(xì)胞，有顯著升高的sry基因表達(dá)水平（1.00±0.22 vs.2

20、.83±0.74，p＜0.05），心肌梗死明顯面積縮小[(31.58±4.36)％vs.(20.25±5.36)％，p＜0.05]，梗死周邊的毛細(xì)血管密度顯著增加[(10.68±3.22)/HP vs.(15.17±3.83)/HP，p＜0.05]，心室重構(gòu)和遠(yuǎn)期心功能也明顯改善[LVEF:(35.32±3.6)％vs.(42.33±5.2)％; LVFS:(20.35±1.56)％ vs.(25.35±3.22)％; LVIDs:(7