EP4受體拮抗劑抑制前列腺癌轉移的實驗研究.pdf

1、前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在世界范圍內居男性惡性腫瘤中的第2位。近年來我國PCa的發(fā)病率呈上升趨勢，目前在男性惡性腫瘤中居第3位，70歲以上PCa居泌尿男性生殖腫瘤發(fā)病率的第1位。在我國大多數PCa發(fā)現時已處于晚期或存在轉移，使得5年生存率低和病死率高成為我國PCa流行病學的主要特點。
　　PCa與雄激素關系密切，臨床上普遍運用藥物或手術去勢阻斷雄激素治療晚期PCa，但大部

2、分雄激素依賴性PCa經過治療終將進展為雄激素非依賴性PCa（Androgen Independent Prostate Cancer,AIPC）。目前，治療AIPC尚缺乏有效方法，傳統的治療方法均無法明顯提高其生存期。骨轉移是PCa最常見最重要的轉移途徑，絕大部分的晚期PCa和AIPC均存在骨轉移。骨轉移及其并發(fā)癥可顯著降低前列腺癌患者的生存質量和生存期，因此尋找新型有效的防治方法以有效治療PCa的（骨）轉移成為研究領域中的熱點。

3、>　　炎癥在PCa的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，使用非甾體類抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drug,NSAID）特別是其選擇性環(huán)氧化酶2（Cyclooxgenase2,COX2）抑制劑可以治療和預防PCa。但是由于NSAID及COX-2抑制劑存在的胃腸道和心血管系統的不良反應使這些研究取得的實際應用成果極其有限。EP4是前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）的4種特異性受體之一，作為

4、COX2的下游位點和PGE2的調控產物，EP4具有更高的選擇性和安全性。雖然研究表明其在多種腫瘤中表達異常增高，選擇性地阻斷EP4受體可以抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移，但迄今為止，EP4受體及其拮抗劑在PCa的發(fā)生發(fā)展特別是轉移中的作用報道很少，提示這一領域的研究仍處在早期探索階段。
　　目的：
　　本課題旨在通過體外及體內實驗探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉移性惡性表型及轉移瘤模型之間的關系。
　　1.在體外實驗水平

5、，檢測EP4受體在激素依賴性PCa LNCaP細胞及AIPCPC3細胞中的表達，觀察不同EP4表達水平PCa細胞惡性表型的變化情況及EP4受體拮抗劑對各細胞轉移性惡性表型的抑制情況。
　　2.在體內實驗水平，探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉移之間的關系。
　　方法：
　　1.在體外實驗水平，應用轉染技術構建EP4過表達的LNCaP細胞（LNCaP/EP4+），應用熒光實時定量聚合酶鏈反應（realtime quant

6、itive polymerase chain reaction，Realtime qPCR）和免疫蛋白印跡法（Western-blot）檢測EP4受體mRNA和蛋白在激素非依賴性PCa LNCaP細胞、LNCaP/EP4+和AIPC PC3細胞中的表達，應用細胞侵襲實驗觀察各細胞的侵襲能力變化及其與EP4表達的關系；以不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L）的EP4受體拮抗劑ONO-AE3-208作用于細胞，應用

7、細胞生長實驗、劃痕愈合實驗和細胞侵襲實驗觀察EP4受體拮抗劑對細胞惡性表型的抑制作用；
　　2.在體內實驗水平，構建熒光素酶（Luciferase）轉染的PC3/LUC細胞，應用左心室注射法和局部注射法構建小鼠PCa癌轉移模型。實驗組應用ONO-AE3-208作用于模型，對照組應用超輕水（deuterium depleted water，DDW），應用活體生物發(fā)光成像技術（IVIS Xenogen系統）觀察不同時期實驗組與對照組小

8、鼠腫瘤生長大小及骨轉移發(fā)展情況并觀察小鼠轉移腫瘤的熒光負荷量，比較兩組之間的差異，觀察EP4受體拮抗劑對PCa骨轉移的作用。觀察PCa轉移瘤的發(fā)生發(fā)展情況，以探討EP4受體及其拮抗劑與PCa轉移之間的關系。適當時期將對照組小鼠處死后取PCa骨轉移組織標本HE染色觀察骨細胞破壞情況，分析EP4受體在PCa骨轉移中的作用。
　　結果：
　　1.結合Realtime qPCR、Western-blot以及細胞侵襲實驗的結果顯示，各

9、細胞的侵襲能力與細胞中EP4受體的表達水平呈現相關關系。
　　2.應用不同濃度（0.1μmol/L、1μmol/L和10μmol/L）的EP4受體拮抗劑ONO-AE3-208作用于各細胞。細胞生長實驗的結果顯示EP4受體拮抗劑對各細胞的增殖沒有影響（P>0.05）；劃痕愈合實驗和細胞侵襲實驗結果顯示，EP4受體拮抗劑可以抑制細胞的遷移和侵襲（P<0.05）。
　　3.成功應用左心室注射法和局部注射法構建小鼠PCa癌全身骨轉移

10、模型和長骨局部轉移瘤模型，分別于注射后第20天和第15天觀察到轉移瘤生長，應用活體生物發(fā)光成像技術（bioluminescence imaging，BLI）（IVIS Xenogen系統）顯示隨著時間變化實驗組小鼠轉移腫瘤的熒光負荷量明顯低于對照組(P<0.01)。病理染色顯示可以觀察到對照組PCa骨轉移組織標本骨細胞破壞。
　　結論：
　　1.本研究結果表明PCa細胞EP4表達水平與細胞遷移及侵襲等轉移性惡性表型呈正相關。

11、
　　2.應用EP4受體拮抗劑可以于體外抑制PCa細胞的轉移性惡性表型。
　　3.成功應用左心室注射法構建小鼠PCa癌全身骨轉移模型，為轉移性PCa體內實驗研究提供了新的研究手段。
　　4.應用EP4受體拮抗劑可以于體內動物模型中抑制PCa的轉移。
　　5.本研究為深入探索EP4受體及其拮抗劑在PCa中作用以及發(fā)生機制奠定了基礎。
　　綜上所述，本研究證明了EP4受體與PCa轉移的相關關系，應用選擇性EP4