鼻咽癌放療抵抗相關microRNA差異表達譜的建立.pdf

1、背景:
　　 鼻咽癌系我國南部及東南亞地區(qū)常見頭頸部惡性腫瘤之一，放射治療為其首選治療手段，但放療抗拒的存在限制了其療效。腫瘤放療抗拒的產生是一個多基因、多因子和多機制共同作用的復雜過程，細胞內或者放療過程中細胞出現(xiàn)對放射線抗拒的細胞成分是腫瘤放療抵抗產生的重要原因。已有的研究顯示DNA修復基因蛋白表達量增高、細胞乏氧效應、放療后促血管生成效應以及自噬性調節(jié)是腫瘤細胞對抗放射線的主要途徑。但放療抗拒的具體分子機制目前仍不清楚。<

2、br>　　 microRNA（miRNA）是一種內源性非編碼RNA，通過結合到靶基因mRNA3’非翻譯區(qū)(3'UTR)抑制其翻譯等機制，調控靶基因mRNA的轉錄進而影響靶蛋白質的表達。miRNA參與到腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等多種惡性生物學行為的調控中。已有研究證實miRNA參與腫瘤放療敏感性的調控。對放療抵抗細胞或組織表達改變的miRNA的篩選，將對鼻咽癌放療抵抗性的逆轉、放療效果的提高提供新的啟示和依據(jù)。
　　 目的

3、:
　　 (1)利用X線梯度照射法建立人鼻咽癌放射抗拒細胞(CNE-2-Rs)，為研究放射抗拒機理提供可比性的成對細胞株。
　　 (2) Illumina Hiseq2000測序系統(tǒng)檢測，與已知數(shù)據(jù)庫進行比對，從兩樣本RNA中篩選出差異表達miRNA，構建放療抵抗microRNA表達譜。通過生物信息學分析差異表達miRNA與及其靶基因，研究可能的生物學功能和機制通路，為放療抵抗相關基因表達及其轉錄后調節(jié)提供更直接的科學線

4、索。
　　 方法:
　　 (1)建立鼻咽癌放療抵抗細胞株:應用X射線梯度照射的鼻咽癌CNE-2細胞系篩選出放療抵抗細胞株CNE-2-Rs; CCK-8法檢測放射后細胞生存率差異;應用細胞克隆形成試驗檢測細胞的放療敏感性;細胞增殖試驗檢測細胞放射后增殖能力差異。
　　 (2)鼻咽癌放療抵抗相關miRNA差異表達譜的建立:將建立的放療抵抗細胞株與其親代細胞株提取RNA，通過Illumina Hiseq2000測序系統(tǒng)

5、檢測，與已知數(shù)據(jù)庫進行比對，從兩樣本RNA中篩選出差異表達miRNA。將差異表達的miRNA分為上調組和下調組，分別利用Target-Scan5.1與PicTar2種計算方法對選定的miRNA進行靶基因預測，交集的基因集合分別進行GO富集分析和KEGG分析，預測可能的靶基因和信號通路。
　　 結果:
　　 (1)X線梯度照射可誘導建立鼻咽癌抵抗細胞:①不同放療劑量下，CCK-8法檢測細胞株CNE-2-Rs的生存率高于CN

6、E-2;②CNE-2-Rs放療后的增殖能力高于CNE-2，放療抑制率低于CNE-2;③細胞株CNE-2-Rs集落形成能力強于CNE-2細胞，多靶單擊模型和線性二次模型擬合細胞存活曲線，相關指標均提示CNE-2-Rs較CNE-2具有放療抵抗性，并具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　 (2)建立鼻咽癌放療抵抗相關miRNA差異表達譜。①篩選出具有差異表達已知miRNA192個（上調107個，下調85個，p＜0.05），其中具有顯著

7、差異的miRNA50個(Fold-change＞1.00或Fold-change＜-1.00，p＜0.05;上調36個，下調14個)。②21個miRNA簇(cluster)和miRNA家族(family)都存2個以上miRNA表達的差異。
　　 信息分析結果:①GO分析提示:下調的14個miRNA對應的靶基因為富集于“生物高聚物修飾(biopolymer modification)”、“蛋白修飾過程(protein modifi

8、cation process)”等28個生物過程(p＜0.05)。上調的36個miRNA未發(fā)現(xiàn)明顯富集的生物過程。②KEGG分析提示:下調的14個miRNA對應的靶基因富集于4條通路“腫瘤相關通路(Pathways in cancer)”、“嘌呤代謝途徑(Purine metabolism)”、“Wnt信號通路(Wnt signaling pathway)”和“軸突導向通路(Axonguidance)”信號通路(q＜0.05);上調的m

9、iRNA未有明顯的富集通路。
　　 結論:
　　 (1)本實驗通過梯度照射模式證實其可以增加細胞的放療抵抗性。結果提示，在體外條件下這種篩選模式也可能篩選或誘導出放射抗拒的細胞，為放療篩選放療抵抗細胞株提供了一個新的放療篩選方案。
　　 (2)鼻咽癌放療抵抗相關miRNA差異表達譜的建立，綜合信息學分析提供了數(shù)個可能的富集生物過程和富集通路，如Wnt通路和相關microRNA，為我們后續(xù)的研究提供了研究的方向和依