持續(xù)去甲腎上腺素輸注對(duì)早期膿毒癥大鼠的保護(hù)作用.pdf

1、目的：
　　膿毒癥(sepsis)是由感染引起的炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)，其發(fā)病率和死亡率都很高。膿毒癥休克是膿毒癥患者的主要的并發(fā)癥之一，常導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡。在膿毒癥休克中，兒茶酚胺類（腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺）藥物對(duì)于升高血壓和穩(wěn)定平均動(dòng)脈壓和心輸出量有重要作用。2008年國(guó)際膿毒癥指南將去甲腎上腺素作為液體復(fù)蘇和多巴胺治療失敗

2、后的進(jìn)一步治療措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)去甲腎上腺素不僅可以用來升高平均動(dòng)脈壓，也能降低炎癥因子和氧化應(yīng)激的水平、改善微循環(huán)和線粒體呼吸功能，但目前仍存在爭(zhēng)議。且隨著對(duì)膿毒癥認(rèn)識(shí)的逐步加深，目前認(rèn)為膿毒癥導(dǎo)致線粒體功能障礙的可能機(jī)制包括微循環(huán)障礙、炎癥因子的損傷作用、氧化應(yīng)激作用、一氧化氮過度表達(dá)和線粒體DNA損傷等。由此可見，去甲腎上腺素對(duì)危重病(尤其是膿毒癥)患者有一定的的保護(hù)和恢復(fù)作用。此外，肝臟是機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝的重要器官，并且

3、在膿毒癥早期極易受損。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討持續(xù)灌注低劑量去甲腎上腺素干預(yù)對(duì)早期膿毒癥大鼠血清炎癥因子、肝臟氧化應(yīng)激水平和線粒體呼吸功能的影響及其相關(guān)機(jī)制，并找出NE的適宜劑量，為臨床上減少膿毒癥嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率和降低膿毒癥病死率提供新的方法和思路。
　　方法：
　　1.建立動(dòng)物模型及分組
　　模型：膿毒癥模型采用腹腔注射10mg/kg脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）建立。分組：40只SD大鼠隨機(jī)分為5

4、組（各組大鼠在實(shí)驗(yàn)前20-24h行右頸外靜脈置管術(shù)）：正常對(duì)照組（n=8）：腹腔注射生理鹽水10ml/kg（與實(shí)驗(yàn)組LPS量一致），同時(shí)持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；
　　內(nèi)毒素組（n=8）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時(shí)持續(xù)泵注生理鹽水1ml/h；去甲腎上腺素干預(yù)組（n=3*8，低劑量組、中劑量組和高劑量組各8只）：腹腔注射LPS10mg/kg，同時(shí)持續(xù)泵注去甲腎上腺素生理鹽水溶液1ml/h，去甲腎上腺用量分別為0.06、0.

5、3、0.6ug/kg/min。
　　2.檢測(cè)指標(biāo)及方法
　　(1)大鼠一般情況：
　　觀察注射LPS前20min及注射后2h、6h、12h和24h的肛溫、心率和呼吸頻率。
　　(2)大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo)：
　　運(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測(cè)注射 LPS(或生理鹽水)后2h、6h的大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-10的濃度。
　　(3)大鼠生化指標(biāo)：
　　肝功能指標(biāo)：運(yùn)用全

6、自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)注射 LPS（或生理鹽水）后24h的大鼠血清ALT和AST水平。
　　(4)大鼠肝臟粒體損傷相關(guān)指標(biāo)（注射LPS或生理鹽水后24h）：
　?、俨捎貌钏匐x心法提取大鼠肝臟線粒體，JC-1染料染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝臟線粒體腫脹程度和線粒體膜電位。
　?、谶\(yùn)用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA法）檢測(cè)大鼠肝臟異檸檬酸脫氫酶活性和線粒體丙酮酸脫氫酶的相對(duì)活性。
　?、圻\(yùn)用比色法檢測(cè)大鼠肝臟線粒體氧

7、化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)（SOD、MDA、NO、iNOS）。
　?、茈婄R觀察大鼠肝臟線粒體損傷狀況，按照Flameng分級(jí)方法對(duì)線粒體進(jìn)行半定量評(píng)分。
　　3.統(tǒng)計(jì)方法
　　獲得的數(shù)據(jù) SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示；多組間比較采用單因素方差分析，在多樣本均數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)進(jìn)行均數(shù)兩兩比較，方差齊性者采用LSD法分析組間差異，方差不齊者采用Games-Howell法分析組間差異；α值界定為

8、0.05。
　　結(jié)果：
　　1.動(dòng)物一般情況：
　　內(nèi)毒素組和去甲腎上腺素干預(yù)組均出現(xiàn)膿毒癥相關(guān)癥狀體征。
　　2.大鼠炎癥反應(yīng)指標(biāo)：
　?。?）各組大鼠血清TNF-α水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清TNF-α水平：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低劑量和中劑量組）血清 TNF-α水平顯著升高(P=0.000、P=0.001、P=0.042)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑

9、量和高劑量組）血清TNF-α水平顯著降低(P=0.037，P=0.039）；
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h各組血清TNF-α水平均檢測(cè)不到。
　　（2）各組大鼠血清IL-1β水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清IL-1β水平：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低劑量組）血清IL-1β水平顯著升高(P=0.07，P=0.04)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-1β水平顯著

10、降低(P=0.02），
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h血清IL-1β水平：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組血清IL-1β水平顯著升高(P=0.033)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-1β水平顯著降低(P=0.041）。
　　（3）各組大鼠血清IL-10水平的比較
　　a、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h血清IL-10水平：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低、中和高劑量組）血清IL-10水平均顯

11、著升高(P=0.001，P=0.000，P=0.000)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-10水平顯著降低(P=0.032），
　　b、腹腔注射LPS（或生理鹽水）后6h血清IL-10水平：
　　與正常對(duì)照組相比內(nèi)毒素組、干預(yù)組（低、中和高劑量組）血清IL-10水平均顯著升高(P=0.001，P=0.000，P=0.000)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（中劑量組）血清IL-10水平顯著降低(P=0.048）。

12、　　3.大鼠生化指標(biāo)：
　　腹腔注射LPS（或生理鹽水）后2h和6h的血清ALT、AST水平：與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組的血清ALT和AST均顯著升高(P=0.048，P=0.028)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組血清ALT和AST有下降趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.大鼠肝臟線粒體指標(biāo)（注射LPS或生理鹽水后24h）
　?。?）各組大鼠肝臟線粒體腫脹程度和膜電位的比較
　　與正常對(duì)照組相比,內(nèi)毒素組和干預(yù)組（低劑量

13、組）肝臟線粒體膜電位顯著下降(P=0.013，P=0.008)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）肝臟線粒體膜電位顯著上升(P=0.03)。大鼠肝臟線粒體腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）各組大鼠肝臟丙酮酸脫氫酶（IDH）活性和肝臟線粒體異檸檬酸脫氫酶（IDH）活性水平的比較
　　與正常對(duì)照組相比,內(nèi)毒素組和干預(yù)組（低劑量組）肝臟線粒體PDH活性水平顯著下降(P=0.009，P=0.009)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）

14、肝臟線粒體PDH活性水平顯著上升(P=0.003)。
　　與正常對(duì)照組相比，內(nèi)毒素組肝臟線粒體IDH活性水平顯著下降(P=0.015)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組（高劑量組）肝臟線粒體IDH活性水平與LPS組相比則顯著升高(P=0.027)。（3）各組大鼠肝臟線粒體SOD、MDA、NO、iNOS水平的比較
　　與正常組相比，各組大鼠肝臟線粒體iNOS、MDA和NO水平有升高的趨勢(shì)；與內(nèi)毒素組相比，干預(yù)組有下降的趨勢(shì)，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、差異。各組大鼠肝臟SOD水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　?。?）各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察及半定量分析
　　各組大鼠肝臟線粒體電鏡觀察改變不明顯，半定量分析無顯著差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.膿毒癥大鼠早期出現(xiàn)肝臟功能損傷、顯著的炎性損傷和線粒體功能受損，但線粒體形態(tài)損傷輕微。
　　2.持續(xù)輸注去甲腎上腺素對(duì)膿毒癥大鼠的有一定的保護(hù)和恢復(fù)作用，這與降低炎癥因子的水平及增強(qiáng)三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性和線粒體膜電