抗人肝細胞肝癌單鏈抗體的制備和鑒定.pdf

1、研究背景： 1.原發(fā)性肝癌的治療現(xiàn)狀 原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其中90％為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。在歐美國家，肝癌是第5位常見的惡性腫瘤；而在中國及東南亞等地區(qū)其發(fā)病率更高，其死亡率為惡性腫瘤的第2位，甚至第1位。在我國每年約有29.3萬人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的58.5％。目前，在世界范圍內(nèi)，其發(fā)病率亦呈上升趨勢。行手術(shù)切除仍然是肝癌首選的、

2、最有效的治療方法，關(guān)鍵是在于早期診斷；但是大多數(shù)的患者在發(fā)現(xiàn)時已屬中、晚期，失去手術(shù)的機會，預后差。目前，肝動脈化療栓塞、肝動脈或門靜脈灌注化療等治療方法?？墒鼓[瘤縮小，使部分病人可因此獲得二期手術(shù)切除的機會。但化療藥物在殺死癌細胞的同時也對體內(nèi)的正常細胞造成損害，這是目前肝癌化學等治療的一個瓶頸問題，臨床醫(yī)生亟需尋求一種新的有效治療方法。 2.腫瘤的生物導向治療現(xiàn)狀 生物導向治療是近年來腫瘤醫(yī)學發(fā)展的趨勢，其中的放射免

3、疫治療更是研究的熱點之一。目前，已有多種抗腫瘤抗體獲得美國FDA的批準，動物實驗及初步的臨床應用結(jié)果令人鼓舞。但是，由于用于臨床研究的絕大多數(shù)都是鼠源性單克隆抗體(monoclonal antibody，MAb)，產(chǎn)生人抗鼠抗體(human anti—mouse antibody，HAMA)反應，影響治療效果甚至引發(fā)嚴重的毒副反應。另外，由于完整抗體的大分子結(jié)構(gòu)，使其難于穿透組織到達靶細胞，嚴重限制了它的應用及發(fā)展。 近年來，基

4、因工程技術(shù)的發(fā)展為解決上述問題帶來了希望。如對鼠單抗恒定區(qū)的人源化(人-鼠嵌合抗體)、可變區(qū)的人源化(人改型抗體、對表面氨基酸殘基的人源化、通過抗體庫技術(shù)人源化等)，亦有一些研究用F(ab)2，F(xiàn)ab’等抗體片段代替完整抗體分子，均取得了一定成果，但仍存在較多問題。 單鏈抗體(single chain fragment of variable，scFv)，作為一種新的基因工程抗體，是目前抗體工程的研究熱點。它是由抗體的重鏈可變區(qū)

5、和輕鏈可變區(qū)通過一段連接肽(linker)連接而成的重組蛋白，是具有完全抗原結(jié)合位點的最小抗體片段，大小為完整抗體分子的1/6，腫瘤穿透力強，避免了抗體Fc段引起的非特異性細胞毒性及免疫原性，并且易于基因操作和基因工程大量生產(chǎn)。 近年來，有關(guān)抗人肝細胞肝癌單鏈抗體的研究雖時見報道，并已取得了一定的成績，但由于特異性不高及抗原異質(zhì)性等原因限制了其進一步的應用。因此，積極制備新的抗肝細胞肝癌單鏈抗體是必要的，為原發(fā)性肝癌的生物導向治

6、療、放射免疫治療和免疫載藥納米的導向治療打下基礎(chǔ)，對有效地減少中晚期肝癌患者的腫瘤負荷以增加二期手術(shù)機會，提高患者的生存期及生活質(zhì)量，具有重要的臨床意義。 本課題分為兩個部分：1、抗人肝細胞肝癌單克隆抗體的制備及其生物學特性的初步鑒定：2、抗人肝細胞肝癌單鏈抗體基因的構(gòu)建及其表達。 第一部分:抗人肝細胞肝癌單克隆抗體的制備及其生物學特性的初步鑒定 目的：制備高特異性、高親和力的抗人肝細胞肝癌(HCC)的單克隆抗體

7、(MAb)，為原發(fā)性肝癌的生物導向治療、放射免疫治療和免疫載藥納米的導向治療奠定基礎(chǔ)。 方法：用人肝癌細胞株HepG—2和SMMC—7721分別經(jīng)多種途徑免疫BALb/c小鼠，取其脾臟細胞與同源小鼠骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14融合，經(jīng)篩選培養(yǎng)、ABC免疫組化法初篩抗體、有限稀釋法亞克隆化、染色體分析、免疫組化鑒定抗體特異性、共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)(LCSM)進行組織定位、ELISA分析鑒定抗體的亞型等進一步鑒定其生物學特性。

8、 結(jié)果：經(jīng)“尾靜脈+脾臟聯(lián)合免疫”方法獲得一株分泌抗人肝細胞肝癌單克隆抗體的雜交瘤，經(jīng)4次亞克隆化體外培養(yǎng)7個多月，仍能穩(wěn)定地分泌單克隆抗體，其染色體為103±5條，并含1～2條中著絲點標志染色體，該抗體與肝癌組織結(jié)合的特異性高達98.5％(67/68)，陽性部位主要定位在肝癌細胞膜及胞漿上，此抗體屬小鼠IgM型。 結(jié)論：“尾靜脈+脾臟聯(lián)合免疫方法”能有效刺激脾臟細胞的增殖，同時大大縮短免疫循環(huán)周期，提高雜交瘤制備的成功率；

9、制備了一株分泌小鼠IgM型抗人肝細胞肝癌單克隆抗體的雜交瘤，其肝癌組織特異性高，陽性部位主要定位在肝癌細胞膜及胞漿上，有著良好的靶向性，對肝細胞肝癌有潛在的診斷及生物導向治療作用。 第二部分:抗人肝細胞肝癌單鏈抗體基因的構(gòu)建及其表達 目的：構(gòu)建抗人肝細胞肝癌單鏈抗體scFv，并在HeLa細胞中表達，為進一步探索原發(fā)性肝癌的生物導向治療、放射免疫治療和免疫載藥納米的導向治療奠定基礎(chǔ)。 方法：從分泌抗人肝細胞肝癌單克

10、隆抗體(MAb)的雜交瘤細胞中提取總RNA，采用針對小鼠Ig家族的混合引物，應用RT—PCR技術(shù)擴增該抗體的VH和VL基因，回收并重組入pGEM—T easy克隆載體上進行測序。根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計特異性引物，引入連接肽linker(Gly4Ser)3，擴增VH和VL并將其連接成具有VH—linker—VL結(jié)構(gòu)的ScFv基因，將其重組入pGEM—T easy克隆載體進行測序。將pGEM—T easy/scFv中的scFv基因片段經(jīng)酶切、連

11、接等反應，亞克隆入pcDNA3.1真核表達載體的相應位點，酶切鑒定后，將重組體pcDNA3.1/scFv轉(zhuǎn)染入HeLa細胞中表達，表達產(chǎn)物純化后，采用SDS—PAGE電泳、Western blot及免疫組化法進行鑒定分析單鏈抗體scFv的特異性及活性。 結(jié)果：計算機分析顯示VH和VL均符合小鼠抗體可變區(qū)的特征；序列分析證實在pGEM—T easy載體上以(Gly4Ser)。連接肽成功構(gòu)建了抗人肝細胞肝癌的scFv單鏈抗體基因，該

12、scFv基因大小為687bp；SDS—PAGE電泳、Western blot及免疫組化分析表明該scFv單鏈抗體在HeLa細胞中成功表達，表達蛋白分子量約為25kD，表達產(chǎn)物可特異性識別及結(jié)合肝癌細胞，而不與正常正常肝臟細胞及其他惡性腫瘤組織結(jié)合，很好地保存了親本單克隆抗體的肝癌特異性及抗體活性。 結(jié)論：構(gòu)建了抗人肝細胞肝癌的scFv單鏈抗體基因，并在體外真核細胞表達系統(tǒng)中實現(xiàn)了scFv的有效表達，分析證實scFv較好地保留了其