水稻矮縮病毒（RDV）微核心蛋白P9轉錄激活活性的研究.pdf

1、水稻矮縮病毒(Rice dwarfvirus，RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。RDV病毒粒子為直徑約70nm的二十面體，基因組由十二條dsRNA組成，根據它們在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率，由慢到快，依次命名為SI~USl2。RDV可以在它的宿主植物水稻和介體昆蟲黑尾葉蟬(Nephotetix cincticps)和電光葉蟬(Recilia dorsalia)中繁殖，并

2、由介體傳播到宿主植物中。 RDV編碼七種結構蛋白和五種非結構蛋白。七種結構蛋白包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9，分別由S1、S2、S3、S5、S7、S8、S9編碼。五種非結構蛋白包括Pns4、Pns6、Pns10、Pns11、Pnsl2，由S4、S6、S10、S11、S12編碼。用RT-PCR的方法從感病水稻葉片中克隆得到RDV S6，S7，S9和Sl2的基因片斷，分別加上HA-tag和Flag-tag，并將其克隆到

3、植物表達載體pCAMBIAl 301中，經測序分析確認無誤后，電轉化農桿菌后注射Nicotiana benthamiana葉片，3-4天取樣，進行Western印跡分析，結果表明克隆到的基因均有表達，為進一步研究基因的功能奠定了基礎。 將RDV微核心蛋白基因S9克隆到酵母表達載體pGBKT7中，轉入AHl09酵母細胞，轉化子可以在SD/Trp<'->His<'->Ade<'->多營養(yǎng)缺陷固體培養(yǎng)基上正常生長，證明RDV P9在酵

4、母中具有轉錄激活活性，運用13-半乳糖苷酶的活性分析對重組質粒轉化子的轉錄激活活性進行定量分析，我們對檢測數據分析發(fā)現與正對照(轉化pGBK-GAD的Y187)相比，轉化pGBK-S9的酵母菌中β-半乳糖苷酶活性可達到正對照的30％左右；與負對照相比pGBK-S9的酵母菌中β-半乳糖苷酶活性增強了200多倍，這說明P9蛋白激活了報告基因的表達。 構建了含有gusA報告基因的植物表達載體用來分析P9在植物中的轉錄激活活性，實驗結果

5、表明，融合GAL4 DBD的P9蛋白可以在植物體內激活報告基因的表達，采用熒光分光光度法定量測定三個效應基因第三天在葉片中激活GUS表達量的情況，融合GAL4 DBD的P9激活GUS強度明顯高于負對照，可以達到正對照的40％以上，Western印跡法證明P9蛋白在酵母和植物中均可以表達。進一步證明在植物體內RDVP9蛋白同樣能夠激活基因的轉錄。 為了檢測RDV P9蛋白在細胞內的分布情況，我們構建了RDV P9與GFP的融合水稻