miR-9對鼻咽癌增殖、腫瘤干細胞“干性”、EMT和轉移的調(diào)控作用及機制.pdf

1、背景和目的：
　　 鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽粘膜的惡性腫瘤，其惡性程度較高，且具有極強的轉移能力。我國是鼻咽癌發(fā)病率最高的國家，以廣東、廣西、湖南、福建等南方地區(qū)為著。早在80年代初，姚開泰就提出了鼻咽癌發(fā)病的三擊/多步假說，認為EB病毒(EBV)、化學致癌物和胚性擊中（即遺傳因素或自發(fā)突變）是構成NPC的主要病因，不僅為一系列后續(xù)研究提供了理論基礎，而且對鼻咽癌的防治具有重要的實踐指導意義。生活方式已被證實和鼻咽癌的發(fā)病有關，尤

2、其吸煙不僅是個體鼻咽癌發(fā)病的危險因素，也與EB病毒血清陽性的健康男性的發(fā)病相關，吸煙能誘導EB病毒的活動。因此，鼻咽癌的發(fā)生是多因素、多基因、多階段、多途徑的。鼻咽癌治療方法包括放射治療、外科手術治療、化學藥物治療、免疫和生物治療，基因靶向治療也為鼻咽癌的治療提供新的前景。
　　 2011年Weinberg指出腫瘤具有自給自足的生長信號、抗生長信號的不敏感、抵抗細胞死亡、潛力無限的復制能力、持續(xù)的血管生成、組織浸潤和轉移、避免免

3、疫摧毀、促進腫瘤的炎癥、細胞能量異常、基因組不穩(wěn)定和突變十種特征，并綜述了針對以上特征的靶向治療方法。大多數(shù)實體瘤的腫瘤微環(huán)境中存在各種類型的細胞，如腫瘤細胞、炎癥細胞、腫瘤干細胞等。腫瘤干細胞(CSCs)是指可以自我更新和分化成為不同表型的腫瘤細胞。腫瘤干細胞假說認為，腫瘤細胞中有一小部分細胞，導致腫瘤發(fā)生和生長，具有無限的自我更新和復制能力，并對放療和化療產(chǎn)生抵抗。不同腫瘤的腫瘤干細胞表面標記物不同?；贑SCs的特性，有效殺滅清除

4、CSCs被認為是根治腫瘤的有效途徑之一。目前針對CSCs的靶向治療主要有靶向抑制其表面標志物，調(diào)節(jié)CSCs通路，誘導CSCs向腫瘤細胞分化，細胞治療(如誘導生成γδT cells殺傷CSC)等。
　　 轉移是惡性腫瘤最基本的生物學特征，腫瘤的轉移是影響患者生存期的首要因素，已成為腫瘤研究領域的熱點和難點，亦是迫切要解決的重大問題之一。腫瘤轉移最突出的特征是不同的腫瘤能在人體內(nèi)相同或不同的部位形成轉移，即腫瘤轉移的組織特異性。上皮

5、-間充質(zhì)轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間充質(zhì)表型細胞的生物學過程，是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，是腫瘤轉移的重要階段。
　　 miRNAs是一種小的內(nèi)源性非編碼RNA分子，大約由21-25個核苷酸組成，在動物和植物，它們是重要的調(diào)節(jié)分子，每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因，它

6、們通過與其靶基因的相互作用來調(diào)節(jié)基因表達，進而調(diào)控生物體的生長發(fā)育。最近的研究表明，一些miRNA調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的過程，在腫瘤的形成中是很重要的，一些miRNAs可作為癌基因或抑癌功能，miRNA表達譜可能成為腫瘤診斷的有用的生物標志物，而miRNAs可能是一個功能強大的工具，用于腫瘤的預防和治療。
　　 研究表明，miR-9在多種人體腫瘤組織中異常表達，如miR-9在乳腺癌、胃癌、卵巢癌等中表達下調(diào)，但在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中表達

7、上調(diào)。miR-9在腫瘤細胞增殖、凋亡、EMT、侵襲、轉移等方面發(fā)揮重要作用。有研究人員的基因芯片結果顯示，miR-9在人NPC組織標本上表達下調(diào)，但功能不詳。
　　 我們的預實驗結果顯示，miR-9在人NPC細胞株中表達下調(diào)，但在NPC組織標本上表達卻上調(diào);同時，miR-9過表達抑制NPC細胞體內(nèi)外增殖，而miR-9過表達卻促進NPC細胞發(fā)生EMT和遷移。以上這些似乎自相矛盾的實驗結果促使我們?nèi)ド钊虢馕鰉iR-9在人NPC發(fā)病中

8、的作用及其機制。
　　 方法：
　　 第一章、miR-9靶向調(diào)控CCNG1抑制鼻咽癌細胞的增殖
　　 1.質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒后，NaAC、乙醇沉淀法純化質(zhì)粒。
　　 2.穩(wěn)定細胞株建立包裝載體PMD2G和穿梭載體PPAX2與目的質(zhì)粒lipotemin2000共轉染至293FT細胞，得到的病毒上清以濃度梯度方式感染細胞，嘌呤霉素2μg/ml(GIBCO)作用約2周殺死未感染細胞，或者流式細胞儀分選出成功

9、感染的細胞。
　　 3.TRIzol—氯仿抽提法提取RNA，按照Bio-Rad逆轉錄試劑盒操作說明書，采用兩步法逆轉錄，實時熒光定量PCR(Realtime qPCR)檢測miRNA和基因mRNA水平的表達。Western blot檢測基因蛋白水平表達。免疫組化檢測組織中基因表達位置和含量。
　　 4.CCK-8法繪制細胞生長曲線，平板克隆實驗觀測細胞增殖情況。
　　 5.流式細胞儀細胞周期檢測。
　　

10、6.熒光素酶活性檢測:
　　 螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的RLU值驗證3'-UTR靶向結合位點活性。
　　 7.皮下成瘤觀測細胞在體內(nèi)的成瘤和增殖情況，肝包膜異位成瘤觀測細胞的成瘤和轉移情況。
　　 8.統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR各細胞株2-ΔΔCt比較采用單因素方差分析(One-way ANONA);轉染后miR-9表達、細胞周期

11、、平板克隆的兩組間比較及免疫組化結果采用兩獨立樣本t檢驗;CCK-8生長曲線及動物實驗中皮下成瘤體積比較采用析因設計的方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，數(shù)值大小以均值±標準差((X)±S)來表示。
　　 第二章、miR-9靶向調(diào)控Hes1在鼻咽癌腫瘤干細胞干性維持中作用及機制
　　 1.TRIzol—氯仿抽提法提取RNA，按照Bio-Rad逆轉錄試劑盒操作說明書，采用兩步法逆轉錄，實時熒光定量PCR(Realtime

12、 qPCR)檢測miRNA和基因mRNA水平的表達。
　　 2.Western blot檢測基因蛋白水平表達。
　　 3.細胞免疫熒光觀察基因在細胞中表達的定位和表達水平。
　　 4.免疫組化檢測組織中基因表達位置和含量。
　　 5.腫瘤球培養(yǎng)、SP細胞比例檢測觀測腫瘤細胞的“干性”。
　　 6.熒光素酶活性檢測:
　　 螢火蟲熒光素酶測定得到的RLU值除以Renilla熒光素酶測定得到的

13、RLU值驗證3'-UTR靶向結合位點活性。
　　 7.miR-9的治療作用:
　　 皮下成瘤后，miR-9 mimics通過轉染試劑注射至瘤體內(nèi)，觀察瘤體生長情況。
　　 8.統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。腫瘤球計數(shù)及免疫組化結果采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　 第三章、c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進鼻咽癌細胞EMT、侵襲和轉移的作用
　

14、　 1.質(zhì)粒擴增提取和純化、穩(wěn)定細胞株建立、熒光素酶活性檢測、Western blotting、免疫組化、細胞免疫熒光見第一、第二章。
　　 2.Transwell遷移試驗、Boyden侵襲試驗和劃痕試驗檢測細胞的轉移能力。
　　 3.熒光標記鬼筆環(huán)肽染色試驗和激光共聚焦觀察細胞骨架變化。
　　 4.掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。
　　 5.細胞粘附試驗和倒置顯微鏡觀測細胞粘附能力。
　　 6.肝包膜下

15、移植后觀測移植位點的成瘤情況及遠處轉移情況。
　　 7.統(tǒng)計學分析:
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR2-ΔΔCt兩兩比較比較采用兩獨立樣本t檢驗;Transwell和Boyden小室結果多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANONA)，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗;細胞粘附能力比較采用析因設計的方差分析。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，數(shù)值大小以均值±標準差（(X)±S）來表示。

16、
　　 第四章、miR-9調(diào)控鼻咽癌細胞中免疫和炎癥相關基因的表達
　　 1.人類基因U133 Plus2.0陣列分析基因表達譜。
　　 2.RNA提取、逆轉、實時熒光定量驗證芯片結果。
　　 3.統(tǒng)計學分析采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。熒光定量PCR各細胞株2-ΔΔCt比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為有統(tǒng)計學差異，數(shù)值大小以均值±標準差（(X)±S）來表示。
　　 結果：<

17、br>　　 第一章、miR-9靶向調(diào)控CCNG1抑制鼻咽癌細胞的增殖
　　 1.miR-9在鼻咽癌細胞株中的表達我們采用實時熒光定量PCR(Real-time qPCR)檢測了miR-9在NP-69、6-10B、5-8F、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1中的表達水平。結果顯示:miR-9在鼻咽癌細胞株上表達較NP-69明顯下降(F=370.010，P=0.000)。
　　 2.構建穩(wěn)定過表達miR-9細胞株將

18、三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)(LV-con或LV-miR-9，PMD2G和PPAX2)共轉染至293T細胞，產(chǎn)生兩種病毒，即空白對照(LV-con)病毒和過表達miR-9(LV-miR-9)的病毒。轉染72h后，收病毒上清感染細胞CNE2、HONE1、SUNE1，48h后觀察綠色熒光，嘌呤霉素殺死未感染的細胞后，用qRT-PCR檢測miR-9表達情況，結果示各種細胞較對照細胞miR-9表達均顯著升高(t=7.355、5.451、5.794，P=0.0

19、18、0.032、0.029)。
　　 3.qRT-PCR檢測鼻咽癌細胞株瞬時轉染miRNAs后miR-9的表達采用脂質(zhì)體法將miR-9 mimics和inhibitor及其對照mimics con和inhibitorcon轉染鼻咽癌細胞株。轉染48h后，提取RNA，逆轉錄后qRT-PCR檢測miR-9的表達。結果示，miR-9 mimics成功使CNE2、HONE1、SUNE1中miR-9過表達(t=7.619、11.224、

20、5.228，P=0.017、0.000、0.035)而inhibitor降低CNE2和5-8F中miR-9的表達水平(t=10.924、14.95，P=0.000、0.004)。
　　 4.miR-9抑制鼻咽癌細胞增殖
　　 4.1 CCK-8和平板克隆形成實驗表明miR-9抑制鼻咽癌細胞增殖我們采用CCK-8法檢測細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)CNE2細胞過表達miR-9后細胞生長變慢，而抑制miR-9后細胞生長加快(P=0.00

21、0)。平板克隆形成實驗示，miR-9可顯著減少CNE2、HONE1、SUNE1細胞克隆形成(t=7.721、2.744、16.545，P=0.000、0.034、0.000)。以上結果表明，miR-9過表達可抑制鼻咽癌細胞增殖。
　　 4.2 miR-9影響鼻咽癌細胞的周期分布為研究miR-9抑制增殖的機制，我們進一步檢測了miR-9對鼻咽癌細胞周期的影響。結果顯示，miR-9過表達后，CNE2和HONE1細胞呈現(xiàn)G0-G1期阻

22、滯，而miR-9抑制后，G0-G1期的細胞較對照組顯著減少。
　　 5.miR-9過表達抑制CNE2細胞的體內(nèi)成瘤能力為研究miR-9對鼻咽癌細胞在體內(nèi)增殖的影響，我們首先將過表達miR-9的CNE2細胞及其對照細胞接種至4只裸鼠背部皮下，細胞數(shù)為1×106個，接種后第34天取材。結果對照組均成瘤，而miR-9過表達組均未成瘤。接著，我們將過表達miR-9的CNE2細胞及其對照細胞的皮下接種細胞數(shù)提高至1.5×106個，接種后第

23、21天取材。結果示，對照組均成瘤，而miR-9過表達組僅一只成瘤。
　　 此外，我們進行了肝包膜下CNE2細胞異位移植成瘤，實驗組與對照組移植細胞數(shù)均為1.2×106個，接種第23天取材，發(fā)現(xiàn)miR-9過表達組在肝包膜下均未成瘤，而對照組全部成瘤。
　　 6.miR-9過表達抑制SUNE1細胞裸鼠皮下成瘤能力如上所述，miR-9過表達的CNE2細胞皮下成瘤能力及肝包膜下異位移植能力均顯著下降。接下來我們研究了miR-9過

24、表達的SUNE1細胞的皮下成瘤能力。將過表達miR-9的SUNE1細胞及其對照細胞接種至5只裸鼠背部皮下，細胞數(shù)為1×106個，接種后第19天取材。結果發(fā)現(xiàn)miR-9過表達的SUNE1細胞成瘤后瘤體較對照組顯著減?。╰=4.279，P=0.003），且生長速度顯著減慢(F=34.112，P=0.000)。此外，miR-9過表達組組織中BrdU+和Ki67+的細胞均較對照組的少。
　　 7.CCNG1為miR-9的靶基因我們發(fā)現(xiàn)在

25、miR-9過表達的鼻咽癌細胞株中CCNG1表達下降，而抑制miR-9后，CCNG1表達升高，在皮下成瘤的瘤體組織中，miR-9過表達組的組織中CCNG1表達下降。生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～9位核苷酸與CCNG1 mRNA3'端-UTR完全互補。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測結果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和miR-9 mimics共轉染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉

26、染可顯著增強熒光素酶活性(t=32.542、6.238，P=0.000、0.003)。突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉染均未明顯改變熒光素酶活性(t=0.455、0.241，P=0.673、0.821)。以上數(shù)據(jù)表明，CCNG1為miR-9的靶基因。
　　 8.miR-9靶向抑制CCNG1表達而使細胞增殖降低為探討CCNG1是否介導了miR-9抑制鼻咽癌細胞增殖的功能，我們

27、首先把HONE1細胞株中CCNG1沉默，以明確CCNG1表達下調(diào)是否亦抑制了細胞增殖;Western blot顯示，miR-9 mimics和siCCNG1均能下調(diào)CCNG1表達，而siCCNG1和miR-9 mimics均能抑制細胞增殖，二者均能使細胞周期G0-G1期細胞增多(F=14.134，P=0.002)，S期減少(F=24.175，P=0.000)。
　　 為研究CCNG1是否有拮抗miR-9的周期阻滯作用，我們在過表

28、達miR-9的HONE1細胞的基礎上進一步過表達CCNG1（LV-miR-9+pC1-CCNG1），結果示，CCNG1表達升高，細胞增殖增快，G0-G1期的細胞減少(F=93.810，P=0.000)，S期和G2-M期細胞顯著增多（F=39.597、25.712，P=0.000、0.001）。綜上，CCNG1介導了miR-9抑制鼻咽癌細胞增殖的功能。
　　 第二章、miR-9靶向調(diào)控Hes1在鼻咽癌腫瘤干細胞干性維持中作用及機制

29、
　　 1.miR-9過表達顯著抑制NPC CSCs的自我更新miR-9過表達可顯著下調(diào)CNE2和SUNE1細胞中干性相關基因(如Nanog、Oct4和ABCG2)表達，而下調(diào)NPC細胞中miR-9表達則導致干性基因表達上調(diào);miR-9過表達可顯著降低NPC細胞中SP細胞含量，并極顯著抑制NPC細胞形成腫瘤球，且過表達組所形成腫瘤球的直徑小于對照細胞的(t=39.436、31.577，P=0.000、0.000)。以上結果表明，

30、miR-9至少抑制了NPC CSCs的自我更新。
　　 2.腫瘤細胞和腫瘤細胞所培養(yǎng)出的腫瘤球間miR-9和Hes1表達差異為了明確Hes1與鼻咽癌腫瘤干細胞的潛在關系，我們對miR-9和Hes1在鼻咽癌細胞（如CNE2和SUNE1細胞）和由其培養(yǎng)出的腫瘤球間基因表達差異進行了分析。結果顯示，miR-9的表達在腫瘤球和腫瘤細胞間無明顯差異(t=0.765、0.653，P=0.487、0.533)，而腫瘤球中Hes1、Sox2、O

31、ct4、Nanog和ABCG2的表達均較腫瘤細胞的高。這預示Hes1在鼻咽癌腫瘤干細胞上發(fā)揮一定的功能。
　　 3.Hes1過表達顯著促進了NPC CSCs的自我更新Hes1過表達可顯著上調(diào)CNE2和SUNE1細胞中干性相關基因(即Nanog和ABCG2)表達，而下調(diào)NPC細胞中Hes1表達則導致干性基因表達下調(diào);流式細胞儀分析表明，Hes1過表達可顯著增加NPC細胞(CNE2和SUNE1細胞)中SP細胞含量，而下調(diào)Hes1則顯

32、著下調(diào)NPC細胞（CNE2和SUNE1細胞）中SP細胞含量;腫瘤球形成實驗表明，過表達Hes1的CNE2和SUNE1細胞較對照組的成球能力顯著增強(t=14.902、20.412，P=0.003、0.000)，而抑制Hes1組的成球能力顯著下降(t=14.248、18.251，P=0.000、0.000)。以上數(shù)據(jù)提示，Hes1參與了NPC CSCs自我更新的調(diào)控。
　　 4.Hes1是miR-9的靶基因既然miR-9參與了NP

33、C CSCs自我更新的調(diào)控，其通過下游哪一個靶基因?qū)崿F(xiàn)？我們的研究發(fā)現(xiàn)，miR-9過表達降低NPC細胞（即CNE2和SUNE1細胞）中Hes1表達，而下調(diào)miR-9表達則導致Hes1表達上調(diào);CNE2和SUNE1細胞的皮下成瘤組織中，miR-9過表達組的Hes1表達下調(diào)。生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～7位核苷酸與Hes1 mRNA3'端-UTR完全互補。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測結果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和m

34、iR-9 mimics共轉染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉染可顯著增強熒光素酶活性(t=23.089、11.573，P=0.000、0.000);突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉染均未明顯改變熒光素酶活性(t=1.075、0.218，P=0.343、0.838)。以上數(shù)據(jù)表明，Hes1為miR-9的靶基因。
　　 5.Hes

35、1介導了miR-9抑制鼻咽癌腫瘤干細胞自我更新的功能在明確Hes1是miR-9的靶基因基礎上，擬進一步闡明miR-9是否通過下調(diào)Hes1表達抑制了鼻咽癌腫瘤干細胞的自我更新。Western blot結果顯示，miR-9和Hes1共同過表達組中Nanog和ABCG2的表達水平較miR-9組的高，SP細胞含量較miR-9組的高，且Hes1過表達后有效阻斷了miR-9抑制腫瘤球形成的能力(F=162.277，P=0.000)。綜上，miR-9

36、抑制鼻咽癌腫瘤干細胞自我更新的功能可由其靶基因Hes1介導。
　　 6.探討miR-9潛在的治療價值為研究miR-9對鼻咽癌的治療作用，我們進行了miR-9的裸鼠皮下瘤內(nèi)注射實驗，首次預實驗中，注射miR-9 Agomir組的三只裸鼠均發(fā)現(xiàn)沿進針方向形成空洞且遷延不愈，而對照組未見空洞（數(shù)據(jù)未展示）。第二次重復實驗中使用miR-9 mimics與MaxSuppressorTM In vivo RNA-LANCErⅡ共注射，結果發(fā)

37、現(xiàn)miR-9可抑制瘤體生長，且部分瘤體中心出現(xiàn)空洞。兩組分別提取組織RNA和蛋白進行分析，結果顯示，實驗組中miR-9成功過表達;且其靶基因CCNG1和Hes1均被抑制。此部分結果正在進行第三次實驗驗證。
　　 第三章、c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進鼻咽癌細胞EMT、侵襲和轉移的作用
　　 1.c-Myc在鼻咽癌細胞中上調(diào)miR-9表達c-Myc過表達上調(diào)鼻咽癌細胞株中miR-9表達，而下調(diào)c-Myc則抑制

38、miR-9表達?？梢?，c-Myc正向調(diào)控了鼻咽癌細胞中miR-9的表達。
　　 2.c-Myc靶向上調(diào)miR-9表達引起EMT相關基因表達變化為明確c-Myc對EMT相關基因是否有影響，我們首先行qRT-PCR檢測EMT相關基因表達情況，結果顯示，c-Myc過表達顯著下調(diào)HONE1細胞中E-cadherin表達(t=-44.880，P=0.000)，而通過RNAi抑制c-Myc表達則升高E-cadherin表達(t=3.149，

39、P=0.035);此外，c-Myc無論過表達還是通過RNAi抑制c-Myc表達均在mRNA水平對N-cadherin和Vimentin表達無顯著影響(P＞0.05)。Westernblot檢測結果表明，c-Myc過表達顯著下調(diào)HONE1細胞中E-cadherin表達，上調(diào)Vimentin表達，而抑制c-Myc表達則上調(diào)E-cadherin表達，并下降Vimentin表達。此外，miR-9 inhibitor能阻斷c-Myc對E-cadh

40、erin和Vimentin的影響，并在CNE2細胞中得到進一步驗證。
　　 3.c-Myc通過上調(diào)miR-9表達促進了NPC細胞遷移和侵襲如上所述，鼻咽癌細胞中miR-9介導了c-Myc對E-cadherin和Vimentin表達的影響，接下來我們研究了c-Myc對鼻咽癌細胞遷移和侵襲的影響及miR-9在其中所起的作用。Transwell結果顯示，c-Myc促進細胞遷移(t=12.231，P=0.000)，Boyden小室結果顯

41、示c-Myc可促進細胞侵襲(t=10.000，P=0.000)，而miR-9 inhibitor可阻斷c-Myc促遷移和侵襲的作用(F=147.016、59.900，P=0.001、0.001)。
　　 4.miR-9對鼻咽癌細胞中EMT相關基因表達的調(diào)控作用在培養(yǎng)穩(wěn)定過表達miR-9的細胞株過程中，發(fā)現(xiàn)CNE2和HONE1細胞形態(tài)發(fā)生了變化，部分細胞變得細長且觸角增多，細胞失去原有的鋪路石樣或規(guī)整的形態(tài)，這提示miR-9過表達

42、可能誘導了EMT。隨后，在基因?qū)用孢M一步明確miR-9是否確實誘發(fā)了EMT。結果表明，miR-9過表達導致SUNE1、CNE2、HONE1、HNE1細胞中上皮相關基因E-cadherin和α-catenin表達下降，而間充質(zhì)相關基因N-cadherin和Vimentin表達升高;下調(diào)miR-9表達則引起CNE2和HONE1細胞中E-cadherin表達升高，而N-cadherin和Vimentin表達下降。以上數(shù)據(jù)提示，miR-9過表達

43、在鼻咽癌細胞上誘導了EMT。
　　 5.miR-9促進鼻咽癌細胞的遷移和侵襲我們進一步采用Transwell和Boyden小室明確miR-9過表達對CNE2和HONE1細胞的遷移和侵襲能力的影響。結果顯示，過表達miR-9的CNE2和HONE1細胞的遷移和侵襲能力較對照組的顯著增強(t=6.533、10.983;13.131、12.351，P=0.000、0.000;0.000、0.000)。劃痕實驗亦顯示，miR-9過表達可促

44、進CNE2和HONE1細胞遷移。綜上，miR-9可促進鼻咽癌細胞遷移和侵襲。
　　 6.miR-9過表達降低鼻咽癌細胞的粘附能力為研究miR-9對腫瘤細胞的粘附能力的影響，我們用0.05nM EDTA處理過表達miR-9的CNE2和HONE1細胞及其對照細胞后，miR-9過表達的鼻咽癌細胞較對照細胞粘附能力下降(F=846.528、751.057，P=0.000、0.000)，提示過表達miR-9的鼻咽癌細胞粘附降低。
　

45、　 7.miR-9對細胞骨架的影響我們用鬼筆環(huán)肽標記法檢測了miR-9過表達對CNE2和HONE1細胞細胞骨架的影響，并用掃描電鏡觀測了細胞的微觀形態(tài)。結果顯示，miR-9過表達的細胞表面纖維增粗增多，偽足增多。Western blot檢測Rho酶和Rac的表達較對照的增多。提示miR-9與細胞形態(tài)改變和偽足形成等轉移起始步驟相關。
　　 8.Klf4為miR-9的靶基因miR-9過表達降低NPC細胞（即CNE2和SUNE1細

46、胞）中Klf4表達，而下調(diào)miR-9表達則導致Klf4表達上調(diào);CNE2和SUNE1細胞的皮下成瘤組織中，miR-9過表達組的Klf4表達下調(diào)。生物信息學軟件預測發(fā)現(xiàn)，miR-9序列5'端2～7位核苷酸與Klf4 mRNA3'端-UTR完全互補。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測結果表明，重組質(zhì)粒wt3'-UTR和miR-9 mimics共轉染可顯著降低熒光素酶活性，而將wt3'-UTR和miR-9 inhibitor共轉染可顯著增強熒光素酶

47、活性(t=4.380、13.777，P=0.012、0.000);突變質(zhì)粒mut3'-UTR和miR-9 mimics或miR-9 inhibitor共轉染均未明顯改變熒光素酶活性(t=0.921、0.302，P=0.409、0.777)。以上數(shù)據(jù)表明，Klf4為miR-9的靶基因。
　　 9.miR-9靶向抑制Klf4進而增強鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力我們的前期研究表明，Klf4在鼻咽癌細胞中具有抑制EMT、遷移和侵襲的功能，

48、為研究Klf4是否具有拮抗miR-9促進遷移和侵襲的作用，我們在HONE1細胞過表達miR-9的基礎上過表達Klf4，結果過表達Klf4組（LV-miR-9+LV-Klf4）的Klf4表達升高，同時遷移和侵襲能力較LV-miR-9組顯著增強(F=137.015、12.438，P=0.000、0.001)。以上提示，Klf4拮抗了miR-9促遷移和侵襲的作用，即miR-9通過靶向抑制Klf4促進細胞遷移和侵襲。
　　 10.c-M

49、yc過表達促進鼻咽癌細胞體內(nèi)轉移為明確c-Myc對鼻咽癌細胞體內(nèi)轉移的影響，我們把過表達c-Myc的CNE2細胞及對照細胞（細胞劑量:1×106/只）分別接種于裸鼠肝包膜下，每組7只裸鼠，結果示接種處全部成瘤，而發(fā)生淋巴結轉移的過表達組有5/7只，而對照2/7只。
　　 第四章、miR-9調(diào)控鼻咽癌細胞中免疫和炎癥相關基因的表達
　　 1.miR-9引起鼻咽癌細胞中干擾素相關基因表達變化微陣列分析顯示，miR-9過表達的

50、CNE2細胞中多種IFN調(diào)節(jié)的基因如IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、PSB9_HUMAN、IFIT2、TRAIL、IFIT1、PSB8_HUMAN、IRF1和B2M的表達都發(fā)生了變化。qRT-PCR進一步驗證了基因芯片結果(P＜0.05或0.01)。
　　 為了進一步證實miR-9對IFN調(diào)節(jié)因子的作用，我們又進行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時轉染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-9

51、 mimics組中IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表達升高，而ISG20和AIM2表達下降。相反，miR-9 inhibitor組中IFI44L、PSMB8、IRF5、PSMB10、IFI27、IFIT2、TRAIL、IFIT1、IRF1、B2M和GBP1表達下降，而ISG20和AIM2表達則升高(P＜0.05或0.01)。
　　 2.m

52、iR-9引起鼻咽癌細胞中主要組織相容性復合體Ⅰ型(MHCⅠ)分子表達變化微陣列分析顯示，miR-9過表達的CNE2細胞中多種主要組織相容性復合體Ⅰ型(MHCⅠ)分子如HLA-B、HLA-H、HLA-C、HLA-F、Q8WW48_HUMAN、NP_001004349.1、Q6ZUW0_HUMAN、019682_HUMAN和TAP1表達升高。qRT-PCR證實了HLA-B、HLA-F和TAP1表達的變化(P＜0.05或0.01)。
　

53、　 為了進一步證實miR-9對MHCⅠ分子的作用，我們又進行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時轉染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)HLA-B、HLA-F和TAP1在miR-9 mimics組中的表達升高，而在miR-9 inhibitor組中表達下降(P＜0.05或0.01)。
　　 3.miR-9引起鼻咽癌細胞白介素(IL)相關基因表達變化微陣列分析顯示，miR-9過表達的CNE2細胞中多種IL相關基因IL20RB、G

54、ALT、IL7、IL1B、IL11、IL1F8、IL1A、IL6和IL7R等表達發(fā)生變化，結果用qRT-PCR證實(P＜0.05或0.01)。
　　 為了進一步證實miR-9對IL相關基因的作用，我們又進行了miR-9 mimics和inhibitor的瞬時轉染，qRT-PCR發(fā)現(xiàn)miR-9 mimics可以顯著上調(diào)一些IL相關基因(IL20RB、GALT、IL7)(P＜0.05或0.01)，而下調(diào)另一些IL相關基因(IL1B、

55、IL11、IL1F8、IL1A、IL6、IL7R)(P＜0.05或0.01)。相反，miR-9 inhibitor下調(diào)IL20RB、GALT和IL7(P＜0.05或0.01)，而上調(diào)IL1B、IL11、IL1F8、IL1A、IL6和IL7R(P＜0.05或0.01)。
　　 結論：
　　 1.miR-9靶向下調(diào)CCNG1抑制NPC細胞增殖;
　　 2.miR-9的靶基因Hesl介導了miR-9抑制鼻咽癌腫瘤干細胞

56、自我更新的功能;
　　 3.c-Myc通過miR-9靶向調(diào)控Klf4促進了鼻咽癌細胞EMT、侵襲和轉移;
　　 4.miR-9可調(diào)節(jié)NPC細胞中免疫和炎癥相關基因表達，提示miR-9可能在炎癥和腫瘤間起橋梁作用;
　　 5.miR-9靶向調(diào)控CCNG1表達抑制了NPC細胞增殖，而miR-9靶向下調(diào)Klf4表達則促進了鼻咽癌細胞EMT、侵襲和遷移，這些預示miR-9可通過靶向調(diào)控不同的靶基因在腫瘤細胞的增殖以及EM