中藥肝復(fù)康在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、肝纖維化是肝臟受到慢性損傷時(shí)的一個(gè)愈合修復(fù)過(guò)程，又是所有慢性肝病進(jìn)展成肝硬化的共同病理基礎(chǔ)。有效的治療肝纖維化可以防止各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在對(duì)肝纖維化啟動(dòng)和進(jìn)展機(jī)制的研究方面取得了一定進(jìn)展。但是在肝纖維化臨床治療領(lǐng)域，并沒(méi)有取得明顯的進(jìn)步。許多西藥由于抗纖維化作用靶位單一，療效并不理想，而有些藥物毒副作用大于治療作用，不宜用于臨床。我國(guó)的中藥復(fù)方制劑具有多種藥效成分協(xié)同作用，安全性強(qiáng)的特點(diǎn)，具有顯著的優(yōu)勢(shì)。中藥肝復(fù)康

2、是本研究室多年來(lái)通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)總結(jié)出的抗纖維化經(jīng)驗(yàn)方，即往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已多次成功證實(shí)了肝復(fù)康對(duì)肝纖維化組織具有預(yù)防及治療作用。本實(shí)驗(yàn)擬在肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)培養(yǎng)體系中加入血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)及中藥血清，應(yīng)用半定量RT-PCR技術(shù)，分別測(cè)定肝星狀細(xì)胞經(jīng)外源性PDGF處理，再通過(guò)不同濃度含藥血清干預(yù)后，其Ⅰ、Ⅲ型膠原及α-SMA

3、 mRNA的變化特點(diǎn)；并以Western blot檢測(cè)不同方式處理后肝星狀細(xì)胞STAT、ERK、P13-K蛋白的不同表達(dá)情況。從而進(jìn)一步揭示中藥肝復(fù)康對(duì)肝星狀細(xì)胞在肝纖維化中的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。 在肝纖維化發(fā)病的分子機(jī)理方面，盡管目前國(guó)內(nèi)外已從基因和轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了許多成功的研究。然而基因的功能活性主要靠蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)，若能直接從蛋白質(zhì)整體水平入手來(lái)研究將更加全面、真實(shí)地揭示肝纖維化的演變過(guò)程。但迄今為止，有關(guān)中藥對(duì)肝星狀細(xì)胞的蛋白質(zhì)組

4、的干預(yù)實(shí)驗(yàn)尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將首次開(kāi)展中藥對(duì)肝星狀細(xì)胞和肝組織蛋白質(zhì)組的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，可望從蛋白質(zhì)組學(xué)角度進(jìn)一步揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制和中藥的藥理作用，為新藥研制提供理論依據(jù)。 方法 一、用RT．PCR方法檢測(cè)Ⅱ、Ⅲ型膠原及值α-SMA mRNA的變化將HSC分為5組：即空白對(duì)照組：加10﹪對(duì)照血清的DMEM；模型對(duì)照組：加10﹪對(duì)照血清+血小板衍生生長(zhǎng)因子(終濃度60ng/ml)的DMEM：肝復(fù)康低劑量組：加10﹪低劑量藥物

5、血清+血小板衍生生長(zhǎng)因子(終濃度60ng/ml)的DMEM；肝復(fù)康中劑量組：加10﹪中劑量藥物血清+血小板衍生生長(zhǎng)因子(終濃度60ng/ml)的DMEM；肝復(fù)康高劑量組：加10﹪高劑量藥物血清+血小板衍生生長(zhǎng)因子(終濃度60ng/ml)的DMEM，分別測(cè)定肝星狀細(xì)胞經(jīng)外源性PDGF處理，再通過(guò)不同濃度含藥血清干預(yù)后，其Ⅰ、Ⅲ型膠原及旺α-SMA mRNA的變化特點(diǎn)。 二、 Western b10t檢測(cè)不同方式處理后STAI、ER

6、K、P13-K蛋白的不同表達(dá)將HSC隨機(jī)分為6組，分別為：對(duì)照組：加10﹪正常對(duì)照血清的DMEM；模型組：加10﹪正常對(duì)照血清的DMEM；中藥組：加10﹪中劑量藥物血清；ERK阻斷劑組：加U0126(ERK阻斷劑，終濃度為10μmol/L)：P13K阻斷劑組：加LY-294002(P13K阻斷劑，終濃度為l0μmol/L)；STAT阻斷劑組：加Parthenolide(JAK-STAT阻斷劑，終濃度為50μ mol/L)。以上各組均作用

7、30分鐘后，除對(duì)照組外，其余各組均加入血小板衍生生長(zhǎng)因子(終濃度60ng/ml)。反應(yīng)10分鐘后，提取不同分組HSC總蛋白樣品，行Western blot檢測(cè)STAT、ERK、P13-K蛋白的不同表達(dá)。 三、二維電泳技術(shù)檢測(cè)肝組織及肝星狀細(xì)胞蛋白質(zhì)分子的動(dòng)態(tài)表達(dá)肝星狀細(xì)胞2-D電泳：制備正常大鼠肝星狀細(xì)胞、加入血小板衍生生長(zhǎng)因子的肝星狀細(xì)胞及加入肝復(fù)康藥物血清和血小板衍生生長(zhǎng)因子的肝星狀細(xì)胞，分別設(shè)定為正常對(duì)照組、模型組及藥物組

8、。分別提取以上各組的總蛋白質(zhì)并進(jìn)行等電聚焦電泳，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。凝膠染色后比對(duì)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，找出上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。 肝臟組織2-D電泳：將對(duì)照組、模型組及藥物組大鼠肝臟取出，提取組織總蛋白質(zhì)，分別進(jìn)行等電聚焦電泳，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。凝膠染色后比對(duì)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，找出上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果 一、藥物血清對(duì)肝星狀細(xì)胞Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的影響在空白對(duì)照組，HSCⅠ、Ⅲ型膠原mRN

9、A表達(dá)呈相對(duì)低水平；加入對(duì)照血清及PDGF刺激的模型對(duì)照組，HSC細(xì)胞顯示出對(duì)外源性PDGF刺激因子的敏感反應(yīng)性，與空白對(duì)照組相比Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)；在藥物血清觀測(cè)組，與模型對(duì)照組相比，由PDGF刺激誘導(dǎo)的HSCⅠ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)增加明顯受到抑制(P<0.01)；不同藥物劑量產(chǎn)生的干預(yù)效果不同，肝復(fù)康各劑量之間比較，以中劑量組Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)降低最明顯，優(yōu)于低劑量組(P<0.01)，和高劑量組相比

10、無(wú)顯著性差異；中劑量組Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)降低亦最明顯，但三個(gè)劑量組之間相比無(wú)顯著性差異。 二、藥物血清對(duì)肝星狀細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響在空白對(duì)照組，HSCα-sMA mRNA表達(dá)呈相對(duì)低水平；而模型對(duì)照組α-SMA mRNA表達(dá)呈明顯升高(P<0.01)；藥物血清各組則均具有能明顯抑制這種升高的作用(P<0.01)，其中以中劑量組干預(yù)效果最為明顯，但三個(gè)劑量組之間相比無(wú)顯著性差異。 三、肝星狀細(xì)胞STAT、E

11、RK、P13K蛋白的表達(dá)情況肝星狀細(xì)胞STAT、ERK、P13K蛋白表達(dá)在不同干預(yù)條件下存在差別，表現(xiàn)為對(duì)照組、模型組、中藥組、阻斷劑組各免疫印跡條帶的灰度及面積不同。中藥可有效抑制STAT、ERK、P13K蛋白的表達(dá)。此外，在分別應(yīng)用STAT、ERK、P13K阻斷劑后，除相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)外，其余兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)也有不同程度的下降。 四、 HSC蛋白質(zhì)的差異展示(一) 培養(yǎng)12小時(shí)后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培養(yǎng)12小時(shí)后

12、，分別提取對(duì)照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過(guò)處理后得出：對(duì)照組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)181個(gè)，模型組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)161個(gè)，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)124個(gè)。 (二) 培養(yǎng)24小時(shí)后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培養(yǎng)24小時(shí)后，分別提取對(duì)照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過(guò)處理后得出：對(duì)照組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)189個(gè)，模型組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)229個(gè)，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)397個(gè)。 (三) 培養(yǎng)48小時(shí)后蛋白質(zhì)的差異展示HSC培

13、養(yǎng)48小時(shí)后，分別提取對(duì)照組、模型組及中藥治療組HSC的總蛋白質(zhì)。通過(guò)處理后得出：對(duì)照組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)118個(gè)，模型組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)183個(gè)，中藥治療組蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)81個(gè)。 (四) 不同治療時(shí)間蛋白質(zhì)的差異展示隨著治療時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，HSC的蛋白質(zhì)表達(dá)在不同時(shí)間有了不同變化．有的變化發(fā)生在治療后24小時(shí)，有的則發(fā)生在治療后的48小時(shí)。 五、肝組織蛋白質(zhì)的差異展示造模4周后，模型組與治療組肝組織總蛋白質(zhì)存在著一定差異。具體體現(xiàn)

14、為：蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)不同，模型組217；治療組241。同時(shí)，部分蛋白質(zhì)在兩組中表現(xiàn)出不同的豐度。 結(jié)論 一、經(jīng)肝復(fù)康含藥血清處理，可下調(diào)HSC-T6細(xì)胞株Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA表達(dá)，不同濃度含藥血清作用強(qiáng)度也有所不同。其中以中劑量組干預(yù)效果最為明顯。中藥肝復(fù)康對(duì)肝纖維化具有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)非特異性干擾PDGF功能，抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原、α-SMA mRNA的轉(zhuǎn)錄，以達(dá)到抗纖維化的作用。 二

15、、應(yīng)用中藥肝復(fù)康可通過(guò)干預(yù)HSC主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而減弱STAT、ERK、P13-K的表達(dá)，以達(dá)到抗肝纖維化的目的。同時(shí)，在分別應(yīng)用STAT、ERK、P13K阻斷劑后，除相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)明顯下調(diào)外，其余兩種蛋白質(zhì)的表達(dá)也有不同程度的下降，因此，我們猜測(cè)在肝星狀細(xì)胞內(nèi)Ras/ERK、P13K和JAK/STAT途徑之間存在著相互作用，既cross-talk。 三、在對(duì)三個(gè)不同時(shí)間段的模型組肝星狀細(xì)胞蛋白質(zhì)的凝膠圖譜比較發(fā)現(xiàn)：每一