miRNA-HNF1α調控軸在肝細胞炎癥反應中的作用.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝損傷是各種肝病共同的病理基礎。目前研究認為，炎癥反應是肝損傷和肝病慢性化至關重要的因素。肝細胞是肝臟最主要的細胞成分。急、慢性肝損傷的炎癥反應及修復過程中均有肝細胞參與。另外，肝細胞表面存在許多炎癥因子的受體，如白介素(Interleukin)受體、腫瘤壞死因子α(TNF-α)受體和轉化生長因子(TGF-β)受體等，表明肝細胞在肝臟的炎癥反應中發(fā)揮重要作用。
　　 肝細胞核因子(hepatoc

2、yte nuclear factors，HNFs)是一系列在肝臟中優(yōu)勢表達的轉錄因子。其中，肝細胞核因子1α(hepatocyte nuclear factor1α，HNF1α)是肝細胞核因子家族(HNFs)的主要成員之一。它可促進肝細胞分化，在肝臟發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在分化成熟的肝細胞中高表達，維持肝細胞的生物學功能。既往研究表明，肝臟發(fā)生急性炎癥時，HNF1α可通過促進C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)的

3、表達參與肝臟急性炎癥反應的調節(jié)及修復。此外，炎癥因子白介素-6（interlukin-6，IL-6）可顯著抑制肝臟HNF1α的表達及轉錄激活活性，提示HNF1α可能參與調節(jié)肝臟的炎癥反應及肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
　　 微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛分布于線蟲、果蠅和人類多種組織細胞內，是一類含21-25個核苷酸的單鏈非編碼RNA。miRNA可通過靶向結合于mRNA的3'非翻譯區(qū)，負向調控相應的蛋白表達。既往有諸多

4、研究表明miRNA與炎癥關系密切。它們主要通過靶向作用于炎癥相關通路如NF-κB和JAK-STAT等通路上的重要蛋白起到促進或抑制炎癥反應的作用。miR-21是目前研究較多的炎癥相關的miRNA之一。既往有研究報道m(xù)iR-21可靶向作用于HNF家族的重要成員HNF4α，而我們的前期研究表明HNF4α在肝纖維化過程中表達下調，上調其表達可抑制肝纖維化進展。以上研究提示炎癥相關的miRNA可能與HNF1α在肝纖維化炎癥反應過程的作用有關。<

5、br>　　 基于以上研究背景，本研究旨在探明肝細胞炎癥反應過程中HNF1α表達的變化，以及其表達變化對肝細胞炎癥反應的影響，并進一步探討HNF1α表達下調過程中miRNA可能發(fā)揮的作用，確定炎癥相關miRNA-HNF1α調控軸在肝細胞炎癥反應中的作用，為慢性肝病的防治提供新的思路及策略。
　　 [實驗方法]
　　 一、肝細胞炎癥反應過程中HNF1α表達情況
　　 （一）原代肝細胞培養(yǎng)過程中HNF1α及炎癥因子表

6、達的變化
　　 分離正常SD大鼠原代肝細胞并體外培養(yǎng)，收取第1、3、5、7天細胞RNA及蛋白，Real-time PCR檢測TNF-α、IL-6 mRNA表達，Western Blot檢測各組HNF1α蛋白表達。
　　 （二）DMN模型大鼠原代肝細胞中HNF1α及炎癥因子表達變化
　　 雄性SD大鼠，予1％二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）溶液(100μl/100g)腹腔注射，每周注射

7、3次，共注射2周，觀察動物狀態(tài)。改良后的Seglen兩步膠原酶灌注法分離DMN造模第0及第2周大鼠原代肝細胞，Real-time PCR、WesternBlot檢測肝細胞中HNF1α及炎癥因子的表達。
　　 二、構建重組復制缺陷型腺病毒AdshHNF1α
　　 參照本實驗室既往腺病毒構建方法，構建針對HNF1α的小干擾RNA表達載體(AdshHNF1α)。將AdshHNF1α體外感染大鼠原代肝細胞，Real-time P

8、CR和WesternBlot法檢測HNF1α表達，驗證病毒構建是否成功。
　　 三、下調HNF1α表達對肝細胞炎癥反應的影響
　　 （一）HNF1α表達下降在體外對肝細胞炎癥因子表達的影響分離正常SD大鼠原代肝細胞并體外培養(yǎng)，24 h后以感染復數(shù)(Multiplicity ofinfection，MOI)10感染AdshHNF1α，Western Blot檢測第12h、24h、36h肝細胞中HNF1α表達情況，Real-

9、time PCR檢測炎癥因子表達水平。
　　 （二）HNF1α表達下降在體內對肝細胞炎癥因子表達的影響
　　 正常SD大鼠經尾靜脈注射AdshHNF1α或對照病毒AdshNC，2×109空斑形成單位(Plaque forming units，Pfu)/只，每周2次，注射3周后處死，留取肝臟組織，抽提肝組織RNA，利用Real-time PCR檢測IL-6、TNF-α的表達水平。利用免疫組織化學方法檢測肝細胞內HNF1α表

10、達情況。
　　 四、miRNA-HNF1α調控軸對肝細胞炎癥反應的調控
　　 （一）炎癥相關miRNA對HNF1α表達的影響
　　 通過軟件預測篩選與HNF1α3'非翻譯區(qū)(3'untranslated region，YUTR)有結合位點的炎癥相關miRNA。同上法分離原代大鼠肝細胞，細胞貼壁后，利用lipo2000分別轉染miR-21、miR-31和miR-146a的擬似物(miRNA mimic)，48小時后

11、收集細胞，抽提RNA及蛋白，Real-time PCR檢測HNF1α mRNA表達，Western Blot檢測HNF1α蛋白表達。
　　 （二）驗證HNF1α為炎癥相關miRNA的靶基因
　　 構建HNF1α3'UTR熒光素酶報告基因質粒。利用lipo2000共轉染miR-21mimic或miR-146α mimic和熒光素酶報告基因質粒，雙報告基因檢測試劑盒檢測報告基因活性，驗證HNF1α是否為miR-21和miR-

12、146a靶基因。
　　 （三）炎癥因子刺激對炎癥相關miRNA及HNF1α表達的影響
　　 分離SD大鼠原代肝細胞，全血清培養(yǎng)2d后，換成含有50 ng/ml IL-6或20 ng/mlTNF-α的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);抽取48 h后細胞的總RNA和蛋白。Western blot法檢測HNF1α表達，Real-time PCR檢測HNF1α及miR-21、miR-146a的表達情況。
　　 （四）DMN、BDL模

13、型大鼠中HNF1α、miR-21和miR-146a表達的相關性
　　 參照本實驗室方法制備膽總管結扎(bile duct ligation，BDL)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)大鼠肝纖維化模型。分別于注射DMN及行BDL術2周后處死大鼠，抽提肝臟組織RNA。Real-time PCR檢測肝組織中HNF1α、miR-21和miR-146a的表達，評價其表達相關性。
　　 五、統(tǒng)計學分析<

14、br>　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行分析，方差齊性采用t檢驗，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗;P＜0.05為具有顯著性差異，JP＜0.01為具有非常顯著性差異。
　　 [實驗結果]
　　 一、肝細胞炎癥反應過程中HNF1α表達下降
　　 （一）原代肝細胞培養(yǎng)過程中HNF1α表達逐漸下降，炎癥因子表達上升
　　 大鼠原代肝細胞體外培養(yǎng)，Real-time PCR檢測結果顯示:隨著培養(yǎng)時間的延長，

15、HNF1α表達逐漸下降，而炎癥因子IL-6、TNF-α的mRNA表達逐漸升高。
　　 （二）DMN模型大鼠原代肝細胞中HNF1α表達下降，炎癥因子表達上升
　　 大鼠腹腔注射DMN造模成功后，分離DMN造模第0及第2周大鼠原代肝細胞，抽提RNA及蛋白，結果顯示與正常大鼠肝細胞相比，DMN造模第2周肝細胞中HNF1α mRNA及蛋白水平顯著下降，IL-6、TNF-α細胞因子mRNA水平明顯上升(P＜0.05)。
　　

16、 二、下調HNF1α表達在體內外均可誘發(fā)肝細胞炎癥反應
　　 （一）HNF1α表達下降在體外對肝細胞炎癥因子表達的影響
　　 分離正常SD大鼠原代肝細胞并體外培養(yǎng)，24 h后以MOI10感染AdshHNF1α，Westem Blot檢測第12h、24h、36h肝細胞中HNF1α表達情況，Real-time PCR檢測炎癥因子表達水平。結果顯示與AdshNC相比，AdshHNF1α可顯著下調肝細胞中HNF1α表達，上調肝

17、細胞中IL-6、TNF-α的表達(P＜0.05)。
　　 （二）HNF1α表達下降在體內對肝細胞炎癥因子表達的影響
　　 正常SD大鼠經尾靜脈注射AdshHNF1α2周后處死，留取肝臟組織。免疫組化結果顯示注射AdshHNF1α后，肝組織內HNF1α表達顯著降低。Real-time PCR結果顯示與AdshNC組相比，AdshHNF1α組IL-6及TNF-α表達顯著升高。
　　 三、miRNA-HNF1α調控軸在

18、肝細胞炎癥反應中的作用
　　 （一）炎癥相關miRNA可下調HNF1α表達
　　 查閱文獻中與炎癥相關的miRNA，利用軟件預測篩選其中與HNF1α3，UTR有結合位點的miRNA，確定下一步繼續(xù)研究的miRNA為miR-21、miR-31和miR-146a。分離原代大鼠肝細胞，轉染miR-21、miR-31和miR-146a的擬似物(miRNA mimic)，48小時后收取細胞RNA及蛋白，檢測HNF1α的mRNA及蛋

19、白表達水平。結果顯示，miR-21和miR-146a可顯著下調HNF1α mRNA及蛋白表達。
　　 （二）驗證HNF1α為炎癥相關miRNA的靶基因
　　 293細胞共轉染miR-21 mimic或miR-146a mimic和HNF1α3'UTR熒光素酶報告基因質粒，雙報告基因實驗結果顯示miR-21 mimic和miR-146a mimic均可使報告基因活性顯著下調，提示HN1α為miR-21和miR-146a靶基

20、因。
　　 （三）炎癥因子刺激肝細胞后炎癥相關性miRNA表達升高，HNF1α表達下降
　　 分離SD大鼠原代肝細胞，全血清培養(yǎng)2d后，換成含有50 ng/ml IL-6或20 ng/mlTNF-α的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);于48 h收集細胞RNA及蛋白。Western blot法檢測HNF1α表達，Real-time PCR檢測HNF1α及miR-21、miR-146α的表達情況。結果顯示經IL-6及TNF-α分別刺激后

21、，肝細胞中HNF1α蛋白表達下降，IL-6及TNF-α中和抗體可部分回復HNF1α蛋白表達。同時Real-time PCR結果提示，IL-6和TNF-α刺激后，肝細胞中miR-21和miR-146a表達升高，HNF1α表達下降。
　　 （四）DMN、BDL模型大鼠肝臟中miR-21、miR-146a和HNF1α表達的相關性
　　 分別于注射DMN及行BDL術2周后處死大鼠，收取肝臟組織RNA。Real-timePCR及相