NDRG2對腫瘤細胞糖代謝抑制作用的研究.pdf

1、三大代謝途徑之一的糖代謝是維持機體穩(wěn)態(tài)的重要代謝途徑。在正常細胞中，葡萄糖是維持細胞生長的主要能源物質。與正常細胞相比，腫瘤細胞具有增殖活躍，生長迅速，能量需求大的特點。作為主要能源物質的葡萄糖對于腫瘤細胞來說具有更加重要的功能，因此干預腫瘤細胞中的葡萄糖代謝必然會對腫瘤細胞的生長產生重大影響。
　　人源NDRG2基因（也叫SYLD/KIAA1248）是NDRG家族成員之一，由我校生化教研室于1999年利用錨定引物PCR法從正常人

2、腦的cDNA文庫中克隆得到的一個新基因[GeneBank登錄號AF159092]。其染色體定位于14q11.2，含有16個外顯子，15個內含子；mRNA全長為2024bp，編碼含有357個氨基酸殘基、分子量約為41kDa的蛋白質。其組織學分布研究結果顯示，該基因在人體多種正常組織呈高表達，而在某些腫瘤組織中則低表達或不表達。從而推測NDRG2可能是一種新的腫瘤抑癌基因。近年來世界上各研究組相繼開展了大量關于NDRG2的研究，結果顯示，N

3、DRG2可以影響細胞的分化[1]，參與阿爾茨海默病的發(fā)生和發(fā)展[2]，在大鼠的腎集合管內通過調節(jié)鹽皮質激素來調節(jié)鈉鹽的代謝[3]，由Akt和PKC磷酸化的NDRG2蛋白可參與胰島素的信號通路[4]。Wielpütz[5]等人發(fā)現(xiàn)NDRG2可能影響非洲光滑爪蟾卵母細胞和大鼠甲狀腺細胞內的鈉通道上皮細胞的功能，增加卵母細胞膜上的電流量，誘導細胞表面鈉通道的表達。同時，生化教研室李燕博士的課題發(fā)現(xiàn)NDRG2可以影響小鼠唾液腺細胞Na+-K+-

4、ATP酶的活性和表達,這些有研究結果提示我們，NDRG2的作用不僅局限在某些轉錄調控的通道上，還可能參與到細胞的物質運輸過程中。
　　那么NDRG2是否會影響腫瘤細胞葡萄糖的攝取從而影響腫瘤細胞的生長呢？帶著這樣的疑問，我們進行了以下四部分實驗：篩選NDRG2差異表達的細胞系；檢測高糖、低糖環(huán)境對細胞生長的影響；檢測細胞內NDRG2表達的改變對細胞內葡萄糖濃度的影響；探索NDRG2影響腫瘤細胞攝取葡萄糖的機制。
　　1.通過

5、Westernblotting方法我們觀察了NDRG2在多種乳腺癌細胞系和肝癌細胞系中的表達情況，經過篩選，我們選取SK-BR-3細胞、T-47D細胞、HHCC和HepG2細胞細胞作為研究對象開展后續(xù)實驗。
　　2.用高糖、低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，檢測細胞內葡萄糖濃度，結果顯示高糖與低糖環(huán)境中的細胞內葡萄糖水平有明顯的差異。用MTT實驗和平板克隆形成實驗檢測細胞的增殖能力，結果發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下的細胞生長較低糖環(huán)境下的細胞生長迅速。

6、>　　3.分別轉染NDRG2siRNA和NDRG2重組腺病毒，在腫瘤細胞內干預NDRG2的表達后，利用葡萄糖檢測試劑盒檢測高糖、低糖環(huán)境中的細胞內葡萄糖濃度，結果顯示高糖環(huán)境中的細胞內葡萄糖濃度隨NDRG2的改變發(fā)生明顯的變化，當細胞內NDRG2水平升高時，細胞內葡萄糖濃度降低，當細胞內NDRG2水平降低時，細胞內葡萄糖濃度升高；而低糖環(huán)境中細胞內葡萄糖濃度未隨NDRG2的改變而發(fā)生明顯的變化。
　　4.哺乳動物體內主要的葡萄糖轉

7、運載體GLUT1定位在細胞的質膜上，在多種腫瘤組織中高表達，作為腫瘤細胞攝取葡萄糖的門戶分子發(fā)揮著重要作用。有研究表明，NDRG2可以影響細胞膜上的某些轉運體的功能[5]，具有調節(jié)物質轉運的功能。為了探索NDRG2調節(jié)腫瘤細胞糖代謝功能的機制，我們大膽假設NDRG2可能通過影響GLUT1來影響腫瘤細胞對葡萄糖的攝取，進而影響了腫瘤細胞的糖代謝狀態(tài)。在上述實驗的基礎上我們將細胞轉染NDRG2siRNA后利用Real-timePCR方法和W

8、estern-blotting方法分別檢測細胞內GLUT1mRNA水平和蛋白質水平的變化，結果發(fā)現(xiàn)GLUT1mRNA水平和蛋白質水平并未因NDRG2水平的變化而變化。表明NDRG2不影響GLUT1的表達。但利用免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)，在細胞內NDRG2和GLUT1存在共定位。進一步采用免疫共沉淀實驗證實，二者在細胞內有直接的結合。這些結果提示NDRG2可能通過與GLUT1的直接結合結合影響后者的轉運、定位、功能或降解過程，進而影響腫瘤細胞對葡

9、萄糖的攝取，最終對腫瘤細胞的增殖產生抑制效應。
　　綜上所述，我們首次證實了NDRG2與腫瘤細胞葡萄糖代謝密切相關。在這個過程中，NDRG2通過抑制腫瘤細胞攝取葡萄糖起到抑制腫瘤細胞的生長的作用。在進一步的研究中我們證實細胞內NDRG2與GLUT1存在直接的相互作用，這種相互作用影響了GLUT1的功能，進而影響了腫瘤細胞對葡萄糖的攝取。因此我們推測NDRG2對腫瘤細胞生長的抑制很可能是通過與GLUT1的直接相互作用而實現(xiàn)的。這為N