抑癌基因Numb在惡性胸膜間皮瘤中表達的臨床意義及其功能研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 惡性胸膜間皮瘤(malignantpleuralmesothelioma，MPM)是一種少見的胸膜部侵襲性腫瘤，預后極差。它的發(fā)病通常與接觸石棉有關，盡管自19世紀70年代以來石棉的使用廣受限制，但接觸后的長期潛伏期使間皮瘤的發(fā)病率正持續(xù)上升。預計在2010-2020年間，工業(yè)發(fā)達國家惡性間皮瘤的死亡率將達到高峰。根據(jù)組織形態(tài)學分類，MPM可分為上皮型、肉瘤樣型（纖維型）和混合型三種類型，以上皮型多見。本

2、病傳統(tǒng)治療效果差，確診后中位生存期約為10-12個月。因此，對MPM有效的診療措施亟待研究。近些年來，基因靶向治療在腫瘤領域的成功應用為MPM尋求有效的治療方法奠定了基礎。
　　 Numb是生物體內最重要的細胞命運決定因子之一，被認為參與多種惡性腫瘤的形成，被認為是頗具希望的抑癌基因。Numb是一種膜相關蛋白，其結構包含一個磷酸酪氨酸結合域(phosphotyrosinebinding，PTB)和一個富脯氨酸域(proliner

3、ichregion，PRR);靠近氨基端的PTB域是Numb作用的關鍵部位，可與E3泛素連接酶Mdm2，Lnx，Siah1，Itch相互作用（能夠將目的蛋白質多聚泛素化，進而被蛋白酶體降解）。在Numb與腫瘤形成的研究中發(fā)現(xiàn)，Numb通過參與維持細胞極性和不對稱分裂，上皮間質轉化，蛋白質泛素化降解，抑制Notch，Hedgehog-Gli(簡稱Hh-Gli或Hh)信號傳導通路，上調P53活性而廣泛參與細胞增殖與分化、凋亡與再生等腫瘤發(fā)生

4、的眾多重要的病理生理過程，發(fā)揮其抑制腫瘤形成的作用。最近的研究表明，Numb在乳腺癌，非小細胞肺癌，唾液腺癌，成神經(jīng)管細胞瘤等某些人類腫瘤中都有不同程度的表達缺失;在對人小腦髓母細胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)Numb能夠通過介導Itch依賴的泛素化降解Gli1，從而抑制Hh-Gli通路。然而，Numb在MPM中的表達、對Gli1的調控作用以及Numb與腫瘤形成的關系尚未見報道。
　　 為了探討Numb在MPM發(fā)生、發(fā)展中的作用，進一步以Nu

5、mb為靶點進行基因治療提供理論依據(jù)，本論文從以下三個方面進行了研究:
　　 一.Numb、Gli1在MPM組織中的表達及其臨床意義;
　　 二.Numb在MPM細胞株NCI-H2452中的表達及對Gli1的調控作用;
　　 三.過表達Numb對NCI-H2452細胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響。
　　 實驗方法：
　　 一.探討Numb、Gli1在MPM組織中的表達及其臨床意義
　　 免疫

6、組織化學法檢測Numb、Gli1在61例MPM組織及22例正常胸膜組織中的表達，卡方檢驗進行組間比較;Kruskal-Wallis或Mann-Whitney法檢測Numb、Gli1在MPM中表達與臨床病理參數(shù)之間的關系;Spearman等級相關分析檢驗Numb與Gli1的相互關系;Kaplan-Meier法log-rank檢驗進行單因素生存分析，Cox回歸進行多因素生存分析，檢測Numb、Gli1及各項臨床病理參數(shù)對預后的影響。

7、　　 二.研究Numb在MPM細胞株NCI-H2452中的表達及對Gli1的調控作用
　　 1.首先用qRT-PCR及Westernblot方法檢測了Numb在NCI-H2452細胞中的表達，同時我們將已被證明表達Numb的人胚腎細胞293T作為對照;Westernblot方法檢測蛋白酶體抑制劑MG132作用于NCI-H2452細胞后對Numb蛋白表達的影響。
　　 2.Numb表達載體體外瞬時轉染NCI-H2452細

8、胞，Westernblot方法檢測Numb、Gli1表達;蛋白酶體抑制劑MG132作用于Numb轉染組，Westernblot方法檢測對Gli1表達的影響。
　　 三.檢測過表達Numb對MPM細胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化療敏感性的影響
　　 1.為檢測過表達Numb對NCI-H2452細胞增殖能力的影響，分別于轉染后48、72h采用MTT法檢測細胞存活率。
　　 2.為檢測過表達Numb對NCI-H2

9、452細胞凋亡的影響，轉染后72h采用Hoechst染色和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術分別檢測細胞凋亡形態(tài)的變化和凋亡率。
　　 3.為研究Numb促進NCI-H2452細胞凋亡的機制，采用Westernblot方法檢測凋亡相關蛋白caspase3，9以及細胞色素C、XIAP、survivin的變化。
　　 4.為了進一步確定Numb對MPM化療敏感性的影響，過表達Numb后分別加入3種不同的化療藥物順

10、鉑、培美曲塞、卡鉑作用24h，采用MTT方法檢測細胞存活率。
　　 結果：
　　 一.Numb、Gli1在MPM組織中的表達及其臨床意義
　　 Numb陽性表達率在MPM組明顯低于正常對照組(P＜0.05);MPM組織中Numb表達與Ki-67標記指數(shù)密切相關，Ki-67≤25％的患者中Numb表達強，Ki-67＞25％的患者中Numb表達弱(P＜0.05)。Gli1陽性表達率在MPM組明顯高于正常對照組(P＜0

11、.05);Gli1胞核表達與IMIG分期密切相關，IMIG分期為初期的患者Gli1表達弱，進展期的患者Gli1表達強(P＜0.05)。在MPM組織中，Numb表達與Gli1胞核表達呈顯著負相關(r=-0.361，P＜0.05);Kaplan-Meier法log-rank檢驗進行單因素生存分析，結果顯示在MPM組織中Numb表達缺失與預后不良有關(P＜0.05);此外，病理類型中的上皮型較之于非上皮型為有利預后因素(P＜0.05)。Cox

12、回歸模型分析顯示只有病理類型為獨立的預后因素(HR=1.952，95％CI1.044，3.48P＜0.05)。
　　 二.Numb在MPM細胞株NCI-H2452中的表達及對Gli1的調控作用
　　 1.Numb在MPM細胞株NCI-H2452中的表達
　　 結果顯示NumbmRNA在NCI-H2452和293T細胞表達水平相似，但在蛋白水平，Numb在NCI-H2452細胞中的表達明顯低于293T。經(jīng)蛋白酶體抑

13、制劑MG132作用后，Numb蛋白表達明顯升高，提示Numb在NCI-H2452細胞中低表達或表達缺失與轉錄后抑制有關。
　　 2.在NCI-H2452細胞中過表達Numb后Gli1蛋白表達受到抑制
　　 Numb蛋白在Numb轉染組中表達明顯高于空載體對照組，外源性表達Numb成功。Gli1mRNA在Numb轉染組和空載體對照組比較無明顯差異;而Gli1蛋白在Numb轉染組較之于空載體對照組表達降低，提示Numb抑制了

14、Gli1蛋白表達。蛋白酶體抑制劑MG132作用于Numb轉染組后，Gli1蛋白表達恢復，提示在MG132作用下Numb對Gli1蛋白抑制作用消失。
　　 三.過表達Numb對MPM細胞株NCI-H2452增殖、凋亡和化療敏感性的影響
　　 1.過表達Numb后NCI-H2452細胞增殖受到抑制
　　 MTT檢測結果顯示轉染外源性Numb基因48、72h后，Numb轉染組與空載體對照組或空白對照組比較，OD值明顯降

15、低，結果有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)提示過表達Numb能夠抑制NCI-H2452細胞增殖活力。
　　 2.過表達Numb促進NCI-H2452細胞的凋亡
　　 轉染外源性Numb基因72h后，Hoechst染色在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Numb轉染組細胞凋亡顯著，出現(xiàn)明顯的核固縮，核碎裂，而空載體對照組和空白對照組凋亡細胞相對較少;AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡率（早期凋亡率+晚期凋

16、亡率）顯示，Numb轉染組與空載體對照組或空白對照組比較，凋亡率明顯升高，結果有顯著性差異（均P＜0.01），提示過表達Numb后，促進NCI-H2452細胞凋亡。
　　 3.Numb通過激活caspase-9介導的內源性凋亡途徑促進NCI-H2452細胞凋亡
　　 Westernblot結果顯示同空載體對照組比較，Numb轉染組細胞caspase-3，9活性蛋白和胞質細胞色素C表達明顯升高，XIAP、survivin表

17、達減弱。提示Numb可能通過激活細胞色素C/caspase-9介導的內源性凋亡途徑促進NCI-H2452細胞凋亡。
　　 4.過表達Numb增強NCI-H2452細胞對順鉑和卡鉑的化療敏感性。
　　 MTT檢測結果顯示在相同濃度順鉑或卡鉑作用下，Numb轉染組的細胞存活率明顯低于空載體對照組和空白對照組(P＜0.05，P＜0.01);過表達Numb對培美曲塞作用的3組細胞存活率無明顯影響。提示過表達Numb增強NCI-H

18、2452細胞對鉑類化療藥物的敏感性。
　　 結論：
　　 1.Numb在MPM組織中的表達減弱甚至缺失，并且與高Ki-67標記指數(shù)及不良預后密切相關。
　　 2.Gli1在MPM組織中表達增強，與IMIG分期相關;Numb與Gli1表達負相關，Numb可能通過泛素-蛋白酶體途徑抑制Gli1蛋白的表達。
　　 3.過表達Numb能夠抑制MPM細胞的增殖能力，并通過caspase-9介導的內源性凋亡途徑促進M

19、PM細胞的凋亡。
　　 4.過表達Numb能夠增強MPM細胞對鉑類化療藥物的敏感性。
　　 創(chuàng)新性和意義
　　 1.本課題首次發(fā)現(xiàn)Numb在MPM組織中表達減弱甚至缺失，并且為預后不良的指標。
　　 2.本課題首次在MPM中研究了Numb與Gli1的相關性及Numb對Gli1的調控作用。
　　 3.本課題首次在MPM中研究了Numb對腫瘤細胞增殖、凋亡及化療敏感性的影響，為以Numb為靶點進行基因