高遷移率族蛋白B1-聚乙二醇-聚乙烯亞胺基因傳遞系統(tǒng)的構(gòu)建及性能研究.pdf

1、安全、有效的載體系統(tǒng)是基因治療成功的關(guān)鍵因素之一，普遍使用的載體系統(tǒng)包括病毒載體和非病毒載體兩類，非病毒載體較病毒載體的安全性有了明顯的提高，但到目前為止非病毒型載體的低轉(zhuǎn)染率一直是研究急需解決的問題。對(duì)非病毒載體進(jìn)行化學(xué)改性，偶聯(lián)配體或復(fù)合功能性多肽是目前提高其轉(zhuǎn)染效率的主要手段。本文使用HMGB1/PEG—PEI作為基因載體，通過對(duì)該基因傳遞系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，以期成為具有高轉(zhuǎn)染效率、低毒性、穩(wěn)定性好的基因傳遞系統(tǒng)。主要研究了以下幾方面的

2、內(nèi)容： ⑴接枝共聚物PEG—PEI的合成和表征：以IPDI為擴(kuò)鏈劑合成PEG—PEI共聚物，通過1H—NMR/13C—NMR、FT—IR、DSC、TGA等對(duì)共聚物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，確認(rèn)生成PEG—PEI共聚物。結(jié)果顯示共聚物中PEG與PEI兩嵌段間有氫鍵的相互作用，為部分相容的微相結(jié)構(gòu)。 ⑵復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI的細(xì)胞毒性研究：以MTT法考察復(fù)合載體的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，復(fù)合HMGB1后對(duì)PEI的細(xì)胞毒性無明顯影

3、響，在復(fù)合載體中對(duì)PEI進(jìn)行一定程度PEG化修飾可降低載體的細(xì)胞毒性，PEG化程度越高，細(xì)胞毒性越低，復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI的毒性低于常用陽(yáng)離子聚合物PEI。比較復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI在HeLa、NIH3T3、COS—7細(xì)胞中的IC50值，復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI在這三種細(xì)胞中的IC50值均顯著高于PEI，進(jìn)一步說明復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI的細(xì)胞毒性低于PEI，結(jié)果顯示各細(xì)胞系對(duì)復(fù)合載體HMG

4、B1/PEG—PEI的耐受性大小排序?yàn)椋篘IH3T3>HeLa>COS—7。 ⑶pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元復(fù)合物形成的研究：本章利用圓二色光譜（CD）證明pDNA與HMGB1、pDNA與PEG—PEI之間存在相互作用。原子力顯微鏡（AFM）觀察pDNA/HMGB1二元復(fù)合物和pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元復(fù)合物的表面形貌確認(rèn)HMGB1可有效結(jié)合pDNA，但壓縮pDNA的能力弱于PEG—PEI，采用兩步法制

5、備pDNA/HMGB1/PEG—PEI三元復(fù)合物可以壓縮pDNA形成粒徑均勻的納米級(jí)別的粒子。 ⑷pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物的性能研究：透射電鏡（TEM）觀察pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物粒子形態(tài)呈球形。動(dòng)態(tài)光散射法（DLS）測(cè)定pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物粒徑在20～70nm范圍，結(jié)果顯示復(fù)合HMGB1后，pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物納米粒粒徑變化不明顯；接枝一定量的PE

6、G可明顯降低復(fù)合物的粒徑，但接枝量過高時(shí)（PEG接枝量大于56％）反而使復(fù)合物的粒徑增大；pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物粒子穩(wěn)定性好，長(zhǎng)時(shí)間孵育粒徑未見明顯增大；pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物粒子在離子強(qiáng)度不同的介質(zhì)中均表現(xiàn)出相似的粒徑，具有良好的穩(wěn)定性。復(fù)合HMGB1后對(duì)pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物的表面電位影響不大；PEG化可弱化在不同介質(zhì)中復(fù)合物表面電位的差異，使pDNA/HMGB1/PEG—

7、PEI復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。以瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)考察復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI壓縮結(jié)合pDNA的能力，結(jié)果顯示HMGB1可協(xié)助PEG—PEI與pDNA結(jié)合，PEG接枝量較少時(shí)PEG—PEI結(jié)合pDNA的能力沒有受到明顯影響，當(dāng)PEG接枝量大于56％時(shí)，PEG—PEI結(jié)合pDNA的能力有所下降。通過對(duì)核酸酶穩(wěn)定性試驗(yàn)考察pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物對(duì)DNaseⅠ酶的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示HMGB1/PEG—PEI與pDN

8、A形成的復(fù)合物后均可以保護(hù)pDNA不被DNaseⅠ酶降解。 ⑸pDNA/HMGB1/PEG—PEI復(fù)合物體外轉(zhuǎn)染的研究：利用復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI介導(dǎo)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因（pEGFP—C1）轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，以流式細(xì)胞儀和熒光顯微圖片考察其轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5在HMGB1/pEGFP—C1質(zhì)量比為10（w/w10），N/P20時(shí)轉(zhuǎn)染率達(dá)到最高值，轉(zhuǎn)染率為44.2％

9、，顯著高于常用陽(yáng)離子基因載體PEI（轉(zhuǎn)染率為9.0％）。本文利用pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5（w/w10，N/P20）復(fù)合物考察了細(xì)胞類型，復(fù)合物的分散介質(zhì)對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)果顯示pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5（w/w10，N/P20）在NIH3T3、COS—7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率均高于PEI；復(fù)合物分散介質(zhì)為去離子水可以使pEGFP—C1/HMGB1/PEG—PEI—5復(fù)合物轉(zhuǎn)染率達(dá)到最大。復(fù)合HMGB

10、1和對(duì)PEI進(jìn)行PEG化修飾均能減弱血清對(duì)轉(zhuǎn)染的阻礙作用。 ⑹HMGB1/PEG—PEI介導(dǎo)目的基因pEGFP—VEGF165基因轉(zhuǎn)染的研究：利用ELISA法和RT—PCR法考察復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI介導(dǎo)目的基因pEGFP—VEGF165轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白的表達(dá)水平以及細(xì)胞中VEGF mRNA的表達(dá)情況。ELISA法證實(shí)復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI能在體外成功介導(dǎo)目的基因pEGFP—VEGF

11、165轉(zhuǎn)染多種細(xì)胞系并表達(dá)出VEGF蛋白，蛋白表達(dá)量高于PEI所介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)染的蛋白表達(dá)量。RT—PCR法檢測(cè)經(jīng)復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI介導(dǎo)目的基因pEGFP—VEGF165轉(zhuǎn)染的多種細(xì)胞內(nèi)含有的VEGF mRNA的表達(dá)量，該表達(dá)量同樣高于PEI所介導(dǎo)的體外轉(zhuǎn)染的VEGFmRNA表達(dá)量。 ⑺激光共聚物顯微鏡觀察復(fù)合載體HMGB1/PEG—PEI介導(dǎo)基因傳遞的核轉(zhuǎn)運(yùn)作用：利用激光共聚焦熒光顯微鏡（CLSM）觀察復(fù)合載體H