RNAi沉默STAT3基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生長抑制的體內(nèi)外研究.pdf

1、目的：STAT3(signal transducer and activator of transcription3)是一種雙功能蛋白，存在于細(xì)胞質(zhì)中，并與酪氨酸磷酸化的信號通路相偶聯(lián)，是JAK-STAT途徑中一種重要的底物，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄過程中具有關(guān)鍵性作用；在許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，STAT3可以調(diào)控許多種致瘤的信號通路。STAT3還可以通過EGFR，Src，IL-6等生長因子、細(xì)胞因子的激活，使其DNA的結(jié)合活性上調(diào)，調(diào)控相應(yīng)靶基

2、因的轉(zhuǎn)錄。并且不斷將生存信號向腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞凋亡的作用。EGFR,Src等受體和非受體酪氨酸激酶是VEGF的主要誘導(dǎo)因素，而這些酪氨酸激酶信號是通過多種途徑傳遞的，STAT3則是這些路徑的一個(gè)交匯點(diǎn)，可以直接參與調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，調(diào)控血管的生成。STAT3信號通路與細(xì)胞的分化、增殖、血管生成、凋亡、免疫逃逸和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。STAT3通路持續(xù)的激活可引起細(xì)胞異常增殖及惡性轉(zhuǎn)化。
　　 在我國，乳

3、腺癌呈逐年上升趨勢，在部分大城市占女性惡性腫瘤之首，外科治療歷史悠久，但治療效果并無突破性改善，生物治療被譽(yù)為乳腺癌治療的曙光。乳腺癌是一個(gè)多突變、多因素積累的過程，乳腺癌的病因及發(fā)病機(jī)理目前尚不十分清楚，隨著近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，在分子水平上，人們對乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及治療的探討也更加廣泛，而且也取得了一定成果。目前，與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程有關(guān)蛋白的異常激活或過度表達(dá)的研究更加受到人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)在多種人類惡性腫瘤中

4、都有Stat3的過度激活，沉默Stat3的表達(dá)能夠有效抑制腫瘤的增殖和生長。
　　 RNAi技術(shù)是指在生物體內(nèi)經(jīng)由雙鏈RNA介導(dǎo)其同源序列mRNA發(fā)生的特異性降解，進(jìn)而引起基因沉默?？梢葬槍π盘柾分械亩鄠€(gè)基因或基因簇所共同具有的序列，使多個(gè)基因的表達(dá)同時(shí)被抑制，從而更有效地發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。RNAi是一種快捷，高效的技術(shù)手段，可特異性地抑制基因的表達(dá)，為腫瘤的基因治療研究提供了有力的方法。目前在分子生物學(xué)研究中RNAi是

5、最為活躍的熱點(diǎn)之一。
　　 在本研究中，在用免疫組化法檢測STAT3及pSTAT3在乳腺癌中的表達(dá)情況后，我們利用RNA干擾技術(shù)，以STAT3siRNA轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞，用Western blot及RT-PCR檢測STAT3siRNA對STAT3mRNA和蛋白表達(dá)的抑制，并觀察STAT3siRNA對MCF7細(xì)胞增殖和凋亡的作用。進(jìn)一步進(jìn)行裸鼠移植瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并檢測移植瘤中STAT3mRNA和蛋白表達(dá)受抑制的情況，來進(jìn)一步

6、驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)，為乳腺癌的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：本課題主要研究乳腺癌中STAT3的異常表達(dá)，并應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默STAT3在乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)，觀察其對乳腺癌惡性表型的影響。實(shí)驗(yàn)主要分三部分：
　　 第一部分中采用免疫組織化學(xué)方法，對36例乳腺癌臨床標(biāo)本和10例正常乳腺組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，初步篩選和驗(yàn)證STAT3蛋白的異常表達(dá)情況，觀察STAT3蛋白在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)情況，探討STAT

7、3異常表達(dá)與乳腺癌患者臨床及病理特征之間的關(guān)系，研究STAT3表達(dá)對乳腺癌患者臨床診斷及預(yù)后的意義。
　　 第二部分主要是STAT3siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)STAT3siRNA靶向轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF7細(xì)胞系后，采用TR-PCR檢測STAT3基因的沉默情況，進(jìn)一步用Western blot技術(shù)檢測了RNAi沉默STAT3基因表達(dá)后，STAT3蛋白表達(dá)的變化。再用MTT方法檢

8、測STAT3siRNA轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的變化，用流式細(xì)胞檢測技術(shù)分析了轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡情況的改變。
　　 第三部分中，首先將STAT3siRNA體外轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF7細(xì)胞系，于裸鼠皮下注射轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，建立裸鼠乳腺癌皮下移植瘤動(dòng)物模型，動(dòng)態(tài)觀察荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤生長情況，接種瘤細(xì)胞后第4天，各組均出現(xiàn)肉眼可見瘤體，開始測量荷瘤鼠腫瘤大小，每3天1次測量并記錄腫瘤的長徑(L)和短徑(w)，共測7次，計(jì)算腫瘤體積。依據(jù)記錄數(shù)據(jù)繪制裸

9、鼠的腫瘤生長曲線。接種第7天，每組各取3只荷瘤鼠頸椎脫臼處死，完整剝離腫塊，分別用RT-PCR.及Westem blot檢測腫塊中STAT3 mRNA及STAT3蛋白的變化，對體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。其余每組5只繼續(xù)觀察。接種22天后，頸椎脫臼處死全部裸鼠，迅速剪開皮膚，完整剝離腫塊并稱重。并對處死的荷瘤鼠及剝離的腫塊進(jìn)行拍照。
　　 結(jié)果：
　　 1 STAT3與pSTAT3在乳腺癌中的表達(dá)檢測結(jié)果顯示：
　　

10、 STAT3陽性表達(dá)部位主要位于胞漿，呈棕黃染色。pSTAT3陽性表達(dá)部位主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色。乳腺癌組織中STAT3、pSTAT3蛋白的高表達(dá)率分別為58.30％、55.56％。正常乳腺組織中分別為10％、0％。乳腺癌組陽性率顯著高于正常乳腺組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在乳腺癌中STAT3、pSTAT3陽性細(xì)胞率與乳腺癌的臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間有相關(guān)性，在臨床分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例中，STAT3、pSTAT3蛋白

11、表達(dá)陽性率高(P＜0.05);STAT3蛋白在癌組織中的表達(dá)與年齡和腫瘤大小、病理類型均無明顯關(guān)系(P＞0.05)。
　　 2 Stat3iRNA對乳腺癌MCF7細(xì)胞生長抑制的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：STAT3 mRNA檢測結(jié)果：從條帶顯示上看，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組STAT3mRNA的表達(dá)量較空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組在48h時(shí)明顯減少，非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量與空白對照組無明顯差異。定量分析結(jié)果( STAT3/β

12、-actin)顯示： STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組（24h0.664±0.007，48h0.327±0.020）較空白對照組（1.093±0.018）及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組(24h1.026±0.04848h1.035±0.050)明顯減少，48h值最低(P＜0.05)。非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)。各組細(xì)胞經(jīng)Western blot檢測分析顯示，內(nèi)參照actin為均一顯影的條帶，而STAT3顯影條帶密

13、度不同．其中，非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組細(xì)胞STAT3表達(dá)量較高，而STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞STAT3表達(dá)量顯著下降，在72h時(shí)最明顯。吸光度值分析(STAT3/β-actin)結(jié)果顯示：STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組（48h1.258±0.017，72h0.153±0.006）較空白對照組（1.374±0.022）及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組(48h1.391±0.051，72h1.320±0.033)明顯減少，72h值最低(P

14、＜0.05)。而非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)；從MTT檢測結(jié)果表明，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞A490nm的吸光值明顯減少，增殖能力于48h及72h后明顯下降，與空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組相比較，細(xì)胞生長受到明顯抑制(P＜0.05)。其生長抑制率，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組較空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組明顯增高(P＜0.05)。表明Stat3 siRNA具有抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的能力

15、．流式細(xì)胞儀分析顯示，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為14.79±0.22，明顯高于空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)；而空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組間凋亡率無顯著性差異(P＞0.05)。STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)明顯的凋亡峰AH，而空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組均未見明顯凋亡峰。
　　 3 STAT3siRNA對MCF7細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：
　　 成瘤情況：非特

16、異siRNA-MCF7和STAT3siRNA-MCF7細(xì)胞分別接種于裸鼠背部皮下，經(jīng)過4d后在其接種部位形成肉眼可見的腫瘤結(jié)節(jié)，至第22天觀察結(jié)束時(shí)，空白對照組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的體積及瘤重明顯大于STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)．而空白對照組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的體積及瘤重?zé)o明顯差異(P＞0.05)?？瞻讓φ战M、非特異siRNA-MCF7轉(zhuǎn)染組裸鼠的營養(yǎng)狀況明顯差于STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染組。連續(xù)觀察裸鼠背部移植

17、瘤的生長情況，從第四天開始，每3天測量一次每只裸鼠腫瘤的長徑及短徑，共測七次，繪制各組裸鼠腫瘤的生長曲線圖。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，3組腫瘤的生長速度明顯不同，空白對照組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的生長速度明顯快于STAT3 siRNA轉(zhuǎn)染組．空白對照組、非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的生長速度較接近。瘤細(xì)胞STAT3 mRNA檢測結(jié)果：STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組STAT3 mRNA的表達(dá)水平（條帶窄小，密度低）較空白對照組及非特異siRNA轉(zhuǎn)

18、染組明顯減低，非特異siRNA轉(zhuǎn)染組的STAT3 mRNA表達(dá)水平與空白對照組近似。定量分析(STAT3/actin)結(jié)果顯示，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組（0.743±0.093）較空白對照組（1.106±0.039）及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組（1.016±0.111）明顯減低(P＜0.05)。而非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0.05)。各組移植瘤經(jīng)Western blot檢測分析顯示，內(nèi)參照actin為均一顯影的條

19、帶，而STAT3顯影條帶密度不同．其中，非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組STAT3表達(dá)量較高，而STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞STAT3表達(dá)量顯著下降（條帶密度明顯降低）．定量分析(STAT3/actin)結(jié)果顯示，STAT3siRNA轉(zhuǎn)染組（0.839±0.274）較空白對照組（1.034±0.101）及非特異siRNA轉(zhuǎn)染組（0.963±0.075）明顯減低(P＜0.05)。而非特異siRNA轉(zhuǎn)染組與空白對照組沒有明顯差別(P＞0

20、.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 STAT3、pSTAT3蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，且與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，TNM分期較晚的和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的呈顯著高表達(dá)。STAT3檢測可作為乳腺癌的輔助診斷的一個(gè)指標(biāo)。
　　 2 STAT3siRNA能夠有效沉默STAT3基因，下調(diào)MCF7細(xì)胞系中STAT3mRNA及蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖能力明顯下降。明顯抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞的體外生長。