BDNF對(duì)小鼠未成熟卵母細(xì)胞的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員，不僅在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，同時(shí)也在動(dòng)物和人類(lèi)的卵巢中表達(dá)。研究顯示，BDNF在卵泡早期發(fā)育中起重要作用，而且，BDNF能提高體外成熟的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。本研究在明確BDNF對(duì)昆明小鼠未成熟卵母細(xì)胞體外成熟的作用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入研究了BDNF在細(xì)胞和分子水平對(duì)卵母細(xì)胞作用的機(jī)制。
　　 第一部分：BDNF對(duì)小鼠未成熟卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎發(fā)育能力的影響
　　 目的：觀(guān)察

2、BDNF對(duì)小鼠未成熟卵母細(xì)胞的體外成熟及胚胎發(fā)育能力的影響，并選擇BDNF作用于小鼠未成熟卵母細(xì)胞的最佳濃度。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分三個(gè)部分。首先在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)液（以α-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，添加10%的FBS和0.2IU/ml的FSH）中，添加不同濃度（0、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml）的BDNF，培養(yǎng)小鼠卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物（CEOs），成熟后進(jìn)行體外受精，觀(guān)察卵母細(xì)胞成熟率、受精率和囊胚形成率，從中選擇BDN

3、F作用于小鼠未成熟卵的最佳濃度（5ng/ml）；其次，在常規(guī)體外成熟培養(yǎng)液中除去FSH條件下，改變FBS的濃度（0、5%、10%），添加BDNF（0、5ng/ml），觀(guān)察不同F(xiàn)BS條件下，BDNF對(duì)小鼠CEOs體外成熟及發(fā)育能力的影響，明確BDNF與FBS對(duì)小鼠未成熟卵作用的相互關(guān)系。最后將CEOs脫去卵丘細(xì)胞，用添加5%的FBS的體外成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)，觀(guān)察BDNF5ng/ml的添加與否對(duì)裸卵體外成熟及發(fā)育能力的影響，從而了解BDNF對(duì)未

4、成熟卵的作用是否需要卵丘細(xì)胞的介導(dǎo)。
　　 結(jié)果：當(dāng)體外成熟培養(yǎng)液中含有FSH和10%的FBS時(shí)，與體外成熟對(duì)照組比較，BDNF各濃度組卵母細(xì)胞的成熟率和受精率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但BDNF5ng/ml組的囊胚形成率（75.00%）顯著高于體外成熟對(duì)照組（56.63%），而接近體內(nèi)成熟組（76.92%）。因此，BDNF5ng/ml是促進(jìn)未成熟卵成熟和囊胚發(fā)育的最佳濃度；當(dāng)培養(yǎng)液中僅含F(xiàn)BS（5%和10%）時(shí)，與相應(yīng)的對(duì)照組比較，

5、卵母細(xì)胞成熟率和受精率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但BDNF顯著提高囊胚形成率（FBS5%：21.51% vs. 9.09%，P<0.05；FBS10%：31.76% vs. 18.9%，P<0.05）；當(dāng)培養(yǎng)液中不含F(xiàn)BS、FSH時(shí)，雖然兩組均無(wú)囊胚形成，但BDNF顯著提高了卵母細(xì)胞的受精率（29.72% vs. 10.57%，P<0.05）。同樣，當(dāng)BDNF作用于未成熟裸卵時(shí)，雖然不影響成熟率和受精率，但將囊胚形成率提高了3倍（18.18%

6、vs. 4.65%，P=0.05）
　　 結(jié)論：BDNF作用于小鼠未成熟卵母細(xì)胞的最佳濃度為5ng/ml。在不同的體外成熟培養(yǎng)條件下，BDNF不影響卵母細(xì)胞成熟率，也無(wú)須卵丘細(xì)胞的介導(dǎo)，直接作用于卵母細(xì)胞，促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)的發(fā)育，提高卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。
　　 第二部分：BDNF對(duì)體外成熟的卵母細(xì)胞紡錘體形態(tài)和皮質(zhì)顆粒分布的影響
　　 目的：紡錘體和皮質(zhì)顆粒是卵母細(xì)胞內(nèi)的重要細(xì)胞器，紡錘體的形態(tài)、大小、位置以及

7、皮質(zhì)顆粒的分布都常用作評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的指標(biāo)。在小鼠未成熟卵體外培養(yǎng)過(guò)程中，研究BDNF對(duì)紡錘體形態(tài)、大小、位置以及皮質(zhì)顆粒分布的影響，了解BDNF在細(xì)胞水平對(duì)卵母細(xì)胞作用的具體環(huán)節(jié)。
　　 方法：將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物分別培養(yǎng)在兩種α-MEM體外成熟培養(yǎng)液中（均含5%FBS，不添加或添加5ng/mlBDNF），收集體外培養(yǎng)2h、4h、8h、12h、16h的卵母細(xì)胞，同時(shí)取HCG注射后2h、4h、8h、12h、16h的體內(nèi)成熟卵

8、母細(xì)胞作為正常對(duì)照。用免疫熒光法標(biāo)記微管和中心粒周蛋白，Hochest33258標(biāo)記染色質(zhì)，F(xiàn)ITC-LCA標(biāo)記皮質(zhì)顆粒，共聚焦顯微鏡下分別觀(guān)察卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程、紡錘體形態(tài)和皮質(zhì)顆粒分布，并進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：體內(nèi)和體外成熟的卵母細(xì)胞在減數(shù)分裂進(jìn)程、紡錘體形態(tài)和皮質(zhì)顆粒分布上表現(xiàn)出顯著的差異。與體外成熟卵母細(xì)胞比較，體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程表現(xiàn)出高度的同步性。BDNF不影響卵母細(xì)胞IVM2h減數(shù)分裂的恢復(fù)和IVM1

9、6h的成熟率，但影響了減數(shù)分裂的中間過(guò)程。在IVM8h和12h，BDNF處理組和對(duì)照組卵母細(xì)胞所處的減數(shù)分裂階段存在明顯的差異。體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中期（包括MⅠ和MⅡ）的紡錘體呈兩端逐漸變細(xì)的“紡錘狀”，微管排列緊密，胞質(zhì)中存在較多的微管形成中心，紡錘體100%靠近卵膜；體外成熟的卵母細(xì)胞的紡錘體兩端寬大，呈“桶狀”，微管排列稀疏，胞質(zhì)中的微管形成中心較少，紡錘體靠近卵膜的比例明顯降低。在體外成熟培養(yǎng)液中添加BDNF的條件下，卵母

10、細(xì)胞MⅠ紡錘體的寬度和表面積比對(duì)照組明顯減少（P<0.05）；微管形成中心明顯增多（P<0.01），MⅠ和MⅡ期紡錘體靠近卵膜的比例明顯增加（MⅠ：65.79% vs. 34.29，P<0.01；MⅡ：71.93% vs. 43.24%，P<0.01）。卵母細(xì)胞體內(nèi)和體外成熟過(guò)程中，皮質(zhì)顆粒重排的時(shí)機(jī)不同，體內(nèi)成熟卵母細(xì)胞在皮質(zhì)顆粒分布方面同樣表現(xiàn)出高度的一致性。而在卵母細(xì)胞體外成熟的BDNF處理組和對(duì)照組中，盡管IVM4h和16h皮質(zhì)

11、顆粒分布相似，但在IVM8h和12h，皮質(zhì)顆粒分布的類(lèi)型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在明顯的差異（P<0.05）。IVM8h，BDNF處理組出現(xiàn)第一次無(wú)皮質(zhì)顆粒區(qū)（Stage Ⅳ）的卵母細(xì)胞（31.25%）明顯多于對(duì)照組（12.50%）；IVM12h，BDNF處理組出現(xiàn)皮質(zhì)顆粒在第一極體排出時(shí)形成的分裂溝中聚集（Stage Ⅴ）的卵母細(xì)胞多于對(duì)照組，但對(duì)照組出現(xiàn)第二次無(wú)皮質(zhì)顆粒區(qū)（Stage Ⅵ）的卵母細(xì)胞多于BDNF處理組。
　　 結(jié)論：BD

12、NF在一定程度上改變了卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程，紡錘體的形態(tài)、定位以及皮質(zhì)顆粒的重排。BDNF對(duì)減數(shù)分裂中期紡錘體形態(tài)和定位的改善可能是其促進(jìn)卵母細(xì)胞質(zhì)成熟的一個(gè)重要原因。
　　 第三部分：BDNF作用于體外成熟的卵母細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑
　　 目的：通過(guò)檢測(cè)體外成熟過(guò)程中卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（PKB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化的變化，來(lái)了解BDNF對(duì)PKB和MAPK途徑的影響，初步探索BDNF促進(jìn)卵母

13、細(xì)胞成熟的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　 方法：將卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物分為三個(gè)組：α-MEM中添加5%的FBS（對(duì)照組）；α-MEM中添加5%的FBS和5ng/mlBDNF（BDNF處理組）；α-MEM中添加5%的FBS、5ng/mlBDNF和100nMK252a（一種Trk受體抑制劑，K252a處理組）。分別進(jìn)行體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)0h、1h、2h、3h、6h、16h收集卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。用Western Blot方法檢測(cè)卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)

14、胞內(nèi)PKB和MAPK磷酸化的變化并進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：在卵母細(xì)胞內(nèi)BDNF增強(qiáng)了PKB的活性，延長(zhǎng)了PKB的激活時(shí)間。而在Trk受體抑制劑K252a的作用下，PKB的活性被完全抑制。因此，BDNF對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)PKB的激活可能是通過(guò)與受體TrkB結(jié)合后產(chǎn)生的效應(yīng)。BDNF也在一定程度上增強(qiáng)了MAPK的活性，很可能并不是TrkB的直接受體后效應(yīng)，因?yàn)镵252a不能抑制MAPK的激活。在卵丘細(xì)胞內(nèi)，BDNF延長(zhǎng)了PKB和MAPK活

15、性持續(xù)的時(shí)間。K252a能短暫地抑制了卵丘細(xì)胞內(nèi)PKB的活性，但對(duì)MAPK的活性無(wú)影響。IVM16h，對(duì)照組卵丘細(xì)胞內(nèi)PKB和MAPK的蛋白總量下降，BDNF處理組則保持PKB和MAPK的蛋白總量不變。
　　 結(jié)論：BDNF能增強(qiáng)了卵母細(xì)胞內(nèi)PKB和MAPK的活性，延長(zhǎng)了卵丘細(xì)胞內(nèi)PKB和MAPK的激活時(shí)間。而這很可能與BDNF改善體外成熟的卵母細(xì)胞質(zhì)的成熟有關(guān)。在卵母細(xì)胞，PKB途徑是BDNF與受體TrkB結(jié)合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之