2型糖尿病大鼠肺組織凋亡的變化及羅格列酮干預的研究.pdf

1、早在20世紀70年代Schuyler等就首次提出肺臟可能是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的靶器官之一。隨著糖尿病并發(fā)癥研究的深入，糖尿病肺部損害已經越來越受到關注。1型、2型糖尿病患者存在不同程度的限制性、阻塞性或混合性通氣障礙及彌散障礙，但發(fā)生機制尚不清楚。近年來的研究表明細胞凋亡在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 目的：本試驗旨在通過檢測2型糖尿病大鼠肺組織細胞增殖與凋亡及凋亡相關因子Caspas

2、e-3、Caspase-9表達的變化，探討糖尿病肺組織損傷與凋亡的關系，提出凋亡可能參與糖尿病肺損害，同時觀察具有抗炎作用的噻唑烷二酮類(thiazolidinediones,TZDs)降糖藥物羅格列酮的干預作用，從而為治療糖尿病肺提供實驗依據。 方法：通過高糖、高脂飲食加腹腔注射小劑量鏈尿佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法，建立2型糖尿病大鼠模型，采用光鏡動態(tài)觀察12w、24w時，對照組、糖尿病組、羅格列酮治

3、療組大鼠肺組織的病理改變情況，同時應用 TDT-原位末端標記(TUNEL)法檢測肺組織細胞凋亡的變化，并用免疫組織化學(immunohistochemistry)方法觀察細胞增殖標記物(PCNA)、凋亡相關因子Caspase-3、Caspase-9的表達變化，以期通過對糖尿病大鼠肺組織細胞增殖與凋亡的研究，探討凋亡與糖尿病肺損害的關系，為糖尿病肺損傷機制提供實驗依據。 結果： 1.癥狀、體征: 糖尿病組大鼠在注射

4、STZ后一周內出現多尿、多飲、多食癥狀，12w時癥狀已明顯。隨病程的延長，上述癥狀更加顯著，并出現毛發(fā)干燥，色澤黯淡，反應遲鈍，活動減少。整個病程中體重稍有下降，與正常對照組無統計學差異。羅格列酮治療組大鼠的上述癥狀無明顯改善。 2.生化指標的改變： 12w時，DM組大鼠空腹血糖、胰島素、甘油三酯較對照組明顯增加(P<0.05)。隨著病程延長至24w時DM組大鼠的甘油三酯水平較12w時增高更加明顯，同時膽固醇水平也明顯升

5、高，與對照組和12w DM大鼠相比均有顯著性差異(P<0.01)；而空腹血糖和胰島素一直維持在較高水平，12w與24w的變化不明顯。羅格列酮治療組大鼠空腹血糖、甘油三酯較同期DM組有下降但無統計學意義，胰島素和膽固醇明顯下降，與DM大鼠組相比較.胰島素水平具有顯著差異(p<0.05)。 3.HE染色結果： 光鏡下可見對照組大鼠肺泡分布均勻，結構完整，由單層肺泡上皮和基膜組成，相鄰肺泡之間有少量結締組織。12w DM大鼠肺

6、組織結構紊亂，支氣管壁、肺泡壁增厚，肺泡上皮細胞顯示不清，肺泡萎縮、塌陷，肺間質和血管周圍細胞外基質增多，成纖維細胞增多，并有炎癥細胞浸潤。24w DM大鼠的上述病理改變更加明顯。羅格列酮治療組肺組織病變較對照DM組明顯減輕，但與同期對照組相比較肺組織結構仍有一定的差異。 4 肺組織細胞增殖及TUNEL染色 4.1 PCNA：對照組大鼠在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞的細胞核有弱的陽性表達，12w DM大鼠陽性表達稍增加，

7、染色淺，增殖指數為0.1283±0.0138，大于同期對照組0.0814±0.0120，有差異(p<0.01)；24w DM大鼠陽性表達明顯增多，棕黃色顆粒顏色較深，增殖指數為0.2490±0.0238，多于12w DM大鼠，有顯著性差異(p<0.01)；亦明顯高于同期對照組(0.0981±0.0157，p<0.01)；羅格列酮治療組陽性表達多于對照組，少于24w DM大鼠組，增殖指數為0.1983±0.0120,兩兩比較結果顯示，對照

8、組與24w DM組，對照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p<0.01)。 4.2 肺組織細胞凋亡：在糖尿病組及對照組大鼠肺組織細胞均有凋亡發(fā)生。凋亡肺組織細胞表現為染色質凝集、邊集，核固縮。對照組大鼠在肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞的細胞核有弱的陽性表達，12w DM大鼠陽性表達稍增加，染色淺，凋亡指數為0.2490±0.0238，大于同期對照組0.0981±0.0157，有差異(p<0.01)；24w

9、 DM大鼠陽性表達明顯增多，棕黃色顆粒顏色較深，凋亡指數為0.2447±0.0123，與12wDM組有顯著性差異(p<0.01)；亦明顯高于同期對照組(0.0795±0.0162，p<0.01)；羅格列酮治療組陽性表達多于對照組，少于24w DM大鼠組，凋亡指數為0.1709±0.0140.兩兩比較結果顯示，對照組與24w DM組，對照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p<0.01)。 5 免疫組織化學

10、結果 5.1 Caspase-3在肺組織中的表達 對照組大鼠的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞胞漿、胞膜中可見少量弱的陽性反應。12w DM大鼠陽性表達稍增加，陽性染色見于支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、肺巨噬細胞及炎癥細胞胞膜及胞漿，染色淺；24w DM大鼠在肺組織表達明顯增多，在胞膜及胞漿表達，棕黃色顆粒顏色較深。12w DM大鼠陽性染色光密度值為0.1112±0.0072，大于同期對照組0.0621±0.0019，有差異

11、(p＜0.01)；24w DM大鼠陽性染色光密度值為0.1412±0.0012，大于12w DM大鼠，有顯著性差異(p＜0.01)；亦明顯高于同期對照組(0.0738±0.0065，p＜0.01)；羅格列酮治療組陽性表達多于同期對照組，少于24w DM大鼠組，陽性染色光密度值為0.1293 4±0.0046，兩兩比較結果顯示，對照組與24w DM組，對照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p＜0.01)。

12、 5.2 Caspase-9在肺組織中的表達 對照組大鼠的支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞胞漿、胞膜中可見少量陽性反應。12w DM大鼠陽性表達稍增加，陽性染色見于支氣管細胞、肺泡上皮細胞、肺巨噬細胞及炎癥細胞胞膜及胞漿，染色淺；24w DM大鼠在肺組織表達明顯增多，胞膜及胞漿表達，棕黃色顆粒顏色較深。12w DM大鼠陽性表達稍增加，染色淺，陽性染色光密度值為0.2128±0.0199，大于同期對照組0.05194±0.0023，有

13、差異(p＜0.01)；24w DM大鼠陽性染色光密度值為0.2552±0.0096，大于12w DM大鼠，有顯著性差異(p＜0.01)；亦明顯高于同期對照組(0.0832±0.0192，p＜0.01)；羅格列酮治療組陽性表達多于同期對照組，少于24w DM大鼠組，陽性染色光密度值為0.2261±0.0118，兩兩比較結果顯示，對照組與24w DM組，對照組與羅格列酮組，24w DM組與羅格列酮組之間均有明顯差異(p<0.01)。

14、 6.凋亡指數AI(apoptosis index)與Caspase-3的相關性分析 AI與Caspase-3蛋白的表達之間成正相關(r=0.8675，p<0.0252)。 7.Caspase-3與Caspase-9的相關性分析 Caspase-3蛋白的表達與Caspase-9蛋白的表達之間成正相關(r=0.9250，p<0.0082)。 結論： 1.高糖高脂飲食加小劑量STZ腹腔注射成功制備2型

15、DM大鼠模型；2 型糖尿病大鼠肺組織出現病理改變，表明肺臟是糖尿病的又一靶器官。 2.2型糖尿病大鼠肺組織增殖與凋亡細胞增多，凋亡相關因子Caspase-3，Caspase-9表達上調，表明細胞凋亡參與糖尿病損害肺組織病變的發(fā)生發(fā)展，可能是肺損害的機制之一。 3.羅格列酮治療組大鼠肺組織病理改變明顯減輕，肺組織細胞的增殖與凋亡細胞及Caspase-3、Caspase-9的表達明顯被抑制，表明羅格列酮干預治療可減輕糖尿病肺