Exendin-4對燒傷小鼠脾臟單核細胞免疫反應的影響及其調(diào)控機制.pdf

1、危重病患者神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活和炎癥介質(zhì)的過度產(chǎn)生造成代謝紊亂，出現(xiàn)高分解代謝和胰島素抵抗，引起血糖升高，進一步損傷機體，并且對免疫系統(tǒng)造成損害，降低機體抵抗力和修復能力?？刂蒲悄茱@著降低危重癥患者病死率，縮短監(jiān)護和住院時間，減少并發(fā)癥。而新型腸促胰島素類降糖藥物，如胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide1，GLP-1）及其類似物具有降低血糖和調(diào)節(jié)炎癥的雙重作用，理論上認為應用于危重癥患者具有獨特的優(yōu)勢。臨床試驗

2、也證實GLP-1對危重癥患者高血糖有良好的治療前景，但是也有臨床研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者使用GLP-1類似物可能會引起胰腺炎等副作用。
　　GLP-1類似物在危重癥的基礎(chǔ)研究相對較少，在危重癥患者復雜的體內(nèi)環(huán)境中，GLP-1及其類似物的免疫調(diào)節(jié)作用還不明確。危重癥患者面臨極大的感染風險，而單核細胞在抵抗病原菌入侵和調(diào)節(jié)機體免疫反應方面有重要作用?，F(xiàn)已明確GLP-1類似物能抑制脂肪巨噬細胞誘導的炎癥反應，但對危重癥患者單核細胞的免疫調(diào)節(jié)作

3、用尚不清楚。本實驗采用小鼠燙傷模型，旨在探討危重病的病理情況下GLP-1長效類似物Exendin-4(Ex-4)對單核細胞免疫功能的調(diào)控以及信號轉(zhuǎn)導機制，為Ex-4等腸胰泌素類藥物在危重癥的應用提供預警。
　　目的:
　　(1)闡明Exendin-4對燒傷小鼠脾臟單核細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。
　　(2)探討Exendin-4影響燒傷小鼠脾臟單核細胞免疫調(diào)節(jié)功能可能的信號轉(zhuǎn)導機制。
　　方法:
　　(1)使用

4、細胞增殖-毒性檢測試劑檢測Ex-4對燙傷小鼠脾臟單核細胞和假傷小鼠脾臟單核細胞增殖活性的改變，并分析量效關(guān)系。(2)熒光顯微鏡觀察單核細胞Gαs(stimulating G proteinα-subunit)和Gαi(inhibitory G proteinα-subunit)的表達，激光共聚焦觀察GLP-1R(glucagon-like peptide1 receptor)、GRK-2(G-protein-coupled recept

5、or kinase2)的表達情況。采用Western Blot檢測燙傷小鼠和假傷小鼠單核細胞GLP-1R、GRK-2、Gαs和Gαi的表達差異。ELISA檢測小鼠脾臟單核細胞TNF-α、IL-6、IL-10和TGF-β分泌水平，觀察Ex-4對燙傷后單核細胞的免疫功能的影響。ELISA檢測Ex-4處理的小鼠脾臟單核細胞中cAMP和PKA的變化，觀察燙傷后單核細胞Ex-4的信號通路變化。(3)采用百日咳毒素(pertussis toxin，

6、PTX)阻斷Gαi，采用Forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）和IBMX（磷酸二酯酶抑制劑）增加cAMP含量以及H89阻斷PKA，再給予Ex-4刺激，觀察上述指標的變化，明確燙傷后GLP-1R信號通路的改變是否能導致Ex-4免疫調(diào)控功能的異常。
　　結(jié)果:
　　(1)Ex-4對單核細胞活性的影響:結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ex-4可降低單核細胞活性。中、高劑量Ex-4處理的假傷組單核細胞活性均顯著低于燙傷組(P＜0.05)，而燙傷組細胞增殖

7、活性變化不明顯。
　　(2)重度燙傷對Ex-4信號轉(zhuǎn)導通路的改變:①燙傷后脾臟單核細胞Ex-4信號轉(zhuǎn)導通路分子包括GLP-1R、GRK-2和Gαs含量均下降(P＜0.05)，而Gαi含量升高(P＜0.05)。②高劑量Ex-4對燙傷組單核細胞cAMP的促進作用較假傷組顯著降低(P＜0.05)，但是PKA水平反而高于假傷組(P＜0.05)。
　　(3)Ex-4對燙傷小鼠單核細胞免疫調(diào)控作用發(fā)生改變:①Ex-4作用后，燙傷組單核細

8、胞分泌TNF-α增加(P＜0.05)，而假傷組沒有顯著改變。②兩組單核細胞IL-6的分泌均呈現(xiàn)劑量依賴性增加(P＜0.05)，但兩組之間無顯著差異。③兩組IL-10的分泌均呈劑量依賴性增加，假傷組中濃度Ex-4促進效應已很明顯(P＜0.05)，但燙傷組僅高濃度Ex-4具有促進作用(P＜0.05)。④Ex-4對兩組TGF-β分泌均起顯著抑制作用(P＜0.05)，在假傷組呈顯著的劑量依賴性，但是在燙傷組不同濃度Ex-4的抑制效應沒有顯著差異

9、。
　　(4)PTX阻斷Gαi、Forskolin和IBMX增加cAMP、H89阻斷PKA后，再給予Ex-4刺激，觀察上述指標的變化:①PTX單獨作用能夠增加燙傷組單核細胞IL-6、TNF-α分泌，加入Ex-4擴大這一效應(P＜0.05)。②PTX、Forskolin和IBMX無論單獨作用還是與Ex-4共同作用相對于單獨使用Ex-4均能減少單核細胞分泌IL-10(P＜0.05)。③H89能促進假傷組單核細胞分泌TNF-α，與Ex-

10、4共同作用的效果也一致(P＜0.05)，但是在燙傷組無論H89單獨作用還是與Ex-4共同作用都不能明顯改變單核細胞分泌TNF-α的量。④H89能促進假傷組單核細胞分泌MCP-1(P＜0.05)，但是抑制燙傷組單核細胞分泌MCP-1(P＜0.05)，Ex-4與H89共同作用比H89單獨作用能促進假傷組單核細胞分泌更多的MCP-1(P＜0.05)，燙傷組無這一作用。
　　結(jié)論:
　　(1)Ex-4能刺激單核細胞同時產(chǎn)生促炎和抗炎

11、的細胞因子，表明在重度燙傷后Ex-4的免疫調(diào)節(jié)作用發(fā)生改變，提示臨床GLP-1治療危重癥時應注意GLP-1及其類似物藥理作用的改變。
　　(2)重度燙傷后，Ex-4作用于小鼠脾臟單核細胞的信號通路關(guān)鍵分子發(fā)生明顯變化，影響Ex-4對單核細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　(3)Ex-4的信號轉(zhuǎn)導通路有很強的免疫抑制作用，通過調(diào)節(jié)cAMP和PKA可能糾正GLP-1及其類似物在危重病的中的促炎作用，使GLP-1及其類似物達到即控制血糖又改