殼聚糖纖維及明膠增強的磷酸鈣骨水泥治療骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的:磷酸鈣骨水泥是上世紀八十年代出現(xiàn)的一種新型可吸收的骨替代材料，但是強度低、降解慢、缺乏韌性及約束力等不足使其臨床應用范圍受到限制。本研究將殼聚糖纖維、明膠與磷酸鈣骨水泥按適當比例制成混合物，測定其理化及生物學特性，探索其在矯形外科的臨床應用可能。 方法:(1)通過掃描電鏡觀察、密度、膨脹率、抗張強度測定分析殼聚糖纖維的特征。粘度分析法測量雞卵清溶菌酶體外降解纖維作用，大鼠肌肉植入試驗了解纖維體內(nèi)吸收，大鼠骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)

2、了解纖維細胞毒性。(2)分別以5wt％明膠和蒸餾水為液相制備磷酸鈣骨水泥固化體，測定水泥初步凝結(jié)時間、抗彎強度。掃描電鏡觀察其表面形態(tài)，大鼠骨髓基質(zhì)細胞種植試驗了解添加明膠對水泥細胞相容性的影響。(3)培養(yǎng)3周及3月齡SD大鼠股骨骨髓基質(zhì)細胞，成骨性培養(yǎng)液誘導分化，通過相差顯微鏡觀察，MTT法檢測細胞增殖，鈣鈷法、茜素紅染色了解體外礦化，測定細胞總蛋白含量，RT-PCR測Ⅰ型膠原mRNA表達，透射電鏡觀察等方法比較兩種細胞的差異。(4)

3、通過測定抗彎曲強度，分析固化體相組成、觀察超微結(jié)構(gòu)及體外細胞反應，了解殼聚糖纖維-明膠-磷酸鈣骨水泥復合材料的理化性能及細胞毒性。(5)通過測定抗張強度、抗彎曲強度，觀察微結(jié)構(gòu)、分析紅外光譜、電子能譜等手段探討殼聚糖纖維、明膠聯(lián)合增強磷酸鈣骨水泥可能的機理。(6)制備兔股骨髁上腔性骨缺損模型，分別植入預固化磷酸鈣水泥和殼聚糖纖維-明膠-磷酸鈣復合物，術后1月、3月、6月和12月取材，通過X線、大體觀察、硬組織切片組織學分析等方法評估兩種

4、材料體內(nèi)吸收及成骨情況。(7)高溫煅燒焦磷酸鈣與碳酸鈣混合物，通過X線衍射分析和掃描電鏡觀察，了解不同溫度和保溫時間下所得磷酸四鈣純度及表面形態(tài)。 結(jié)果:(1)殼聚糖纖維光滑，密度1.093±0.270g/cm3，膨脹率2.30±0.21，抗張強度80.18±1.56MPa。加入溶菌酶2小時特性粘度下降約1/2，以后漸趨穩(wěn)定。植入肌肉1周炎癥反應明顯。4周時吸收不明顯，12周大部分吸收。共培養(yǎng)細胞可粘附纖維生長。(2)添加明膠后

5、磷酸鈣骨水泥的初步凝結(jié)時間縮短為5.31±1.18分，對照組為20.72±4.13分；抗彎強度提高到6.14±0.97MPa；對照組為2.48±0.62MPa。固化體表面晶體為顆粒狀，大小約10μm，添加明膠后顆粒狀晶體互相連接，孔隙減少。細胞可在水泥表面貼附、生長。(3)幼鼠細胞增殖快，倍增時間4.8天；培養(yǎng)第7天出現(xiàn)較多集落；鈣鈷法、茜素紅染色深染細胞數(shù)多，結(jié)節(jié)典型；總蛋白含量高。成齡鼠細胞增殖相對慢，倍增時間5.4天；未見細胞集落

6、；總蛋白含量低。兩種細胞瓊脂糖電泳均可顯示Ⅰ型膠原mRNA條帶；幼鼠細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞外基質(zhì)中前膠原樣結(jié)構(gòu)相對豐富。(4)殼聚糖纖維體積比對抗彎強度影響顯著，體積比增加到30％，強度最大為12.31Mpa。纖維及明膠促進水泥向羥基磷灰石轉(zhuǎn)化，各復合物在31°和35°之間均可見與標準羥基磷灰石一致的衍射峰。掃描電鏡顯示纖維分散較好，并被水泥濕化。大鼠骨髓基質(zhì)細胞可在復合物表面生長。短期抽提實驗證實細胞生長無抑制。(5)5wt％和10wt％

7、明膠浸制后的殼聚糖纖維張力強度分別為85.43和91.67MPa，分別比純纖維(80.5MPa)提高1.06及1.14倍。紅外光譜分析提示纖維和明膠間發(fā)生相互作用。力學試驗顯示5wt％明膠和體積比為30％殼聚糖纖維構(gòu)成的復合物抗彎曲強度最大，當纖維體積比增加到50％時，強度降低。5wt％明膠和體積比30％殼聚糖纖維構(gòu)成的磷酸鈣骨水泥復合物之斷口分析見拔出纖維表面粘附有大量的水泥顆粒。(6)兩種材料在任意時間點未見不良反應，1m后復合材料

8、的降解及成骨均優(yōu)于單純水泥組，在觀察時間段(12m)內(nèi)，純水泥組僅表面發(fā)生降解，降解率不足20％，復合材料組呈多方位降解，降解率達67％。(7)燒結(jié)磷酸四鈣所需的最低溫度為1350℃，保溫3小時和6個小時制備的磷酸四鈣純度均可達到90％以上，而且兩種條件得到磷酸四鈣的超微形態(tài)類似。 結(jié)論:(1)殼聚糖編織纖維具有一定強度、良好的生物可降解性及生物相容性，適合構(gòu)建骨或者軟骨組織工程支架。(2)添加明膠可縮短磷酸鈣骨水泥的固化時間，

9、提高抗彎強度及生物相容性。(3)不同鼠齡的骨髓基質(zhì)細胞經(jīng)體外誘導均可分化為成骨細胞，考慮到細胞增殖及成骨潛能，幼鼠基質(zhì)細胞是研究細胞/生物材料相互作用更理想的工具。(4)添加殼聚糖纖維和明膠在一定程度上提高了骨水泥強度，加速骨水泥向羥基磷灰石轉(zhuǎn)化，新型復合材料無細胞毒性。(5)殼聚糖纖維和明膠作為增強劑可以顯著改善水泥的抗彎曲強度，5wt％的明膠和體積比30％的殼聚糖纖維為這種增強模式較為合適的比例。其機理可能與材料之間發(fā)生的化學結(jié)合、