KLF4在血管平滑肌細(xì)胞染色質(zhì)重塑中的作用機(jī)制研究.pdf

1、為了闡明KLF4是否可以募集p300并進(jìn)而介導(dǎo)組蛋白乙?；约捌浞肿訖C(jī)制，本研究用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）誘導(dǎo)VSMC分化，探索KLF4與p300、PTEN等蛋白因子相互作用及其翻譯后修飾的變化，研究KLF4與組蛋白乙?；g的關(guān)系，從表觀遺傳學(xué)角度揭示VSMC表型調(diào)制及分化的新機(jī)制。
　　第一部分 KLF4介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的組蛋白H3乙?；?br>　　目的:觀

2、察TGF-β1是否促進(jìn)組蛋白乙?；?，以及KLF4在組蛋白乙?；兴鸬淖饔谩?br>　　方法:Western blot檢測(cè)組蛋白H3和H4的乙?；?細(xì)胞免疫熒光觀察TGF-β1對(duì)組蛋白H3和H4乙酰化的影響;ChIP法檢測(cè)乙?；疕3、p300和KLF4在p21、TβRI啟動(dòng)子上的富集。
　　結(jié)果:1.組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄激活密切相關(guān)，TGF-β1調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞分化和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。
　　2.過表達(dá)KLF4后，組

3、蛋白H3的乙?；矫黠@升高，TGF-β1處理進(jìn)一步促進(jìn)H3的乙?；Ｇ玫蛢?nèi)源性KLF4后，組蛋白H3的乙?；浇档?，TGF-β1對(duì)H3的乙?；讲辉佼a(chǎn)生影響;但組蛋白H4的乙?；讲皇躃LF4過表達(dá)或敲低的影響。結(jié)果表明，KLF4是TGF-β1誘導(dǎo)組蛋白乙?；仨毜摹?br>　　3.在過表達(dá)KLF4的細(xì)胞中，乙?；虷3水平在1.5 kb的p21啟動(dòng)子區(qū)域均有不同程度的增高，但以-645bp到+57 bp區(qū)域乙?；虷3富集較

4、為明顯，-227bp/+57 bp區(qū)域乙?；虷3的富集程度最大。這一區(qū)域含有KLF4的結(jié)合位點(diǎn)。在敲低KLF4的細(xì)胞中，該區(qū)域乙?；虷3的富集程度降低。這些結(jié)果表明，KLF4介導(dǎo)組蛋白H3的乙酰化并促進(jìn)乙?；疕3在p21啟動(dòng)子區(qū)域的富集。
　　4.TGF-β1增強(qiáng)p300在p21啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)主要定位于-645 bp/-397 bp和-225 bp/57 bp區(qū)域，這兩個(gè)區(qū)域分別包含Smad和KLF4的結(jié)合位點(diǎn)。

5、進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，p300結(jié)合受KLF4的調(diào)節(jié)，在過表達(dá)KLF4的基礎(chǔ)上，再用TGF-β1刺激細(xì)胞12 h，p300在這兩個(gè)區(qū)域的結(jié)合進(jìn)一步增加。靶向敲低KLF4后，p300在此區(qū)域的富集降低。
　　結(jié)論:KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，并促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的組蛋白H3乙酰化。
　　第二部分 p300、PTEN通過與KLF4相互作用，影響其乙?；傲姿峄?br>　　目的:檢測(cè)TGF

6、-β1是否影響KLF4與乙?；竝300、磷酸酶PTEN的相互作用。觀察p300、PTEN對(duì)KLF4修飾狀態(tài)的影響。
　　方法:免疫共沉淀檢測(cè)KLF4與p300、PTEN的相互作用;細(xì)胞免疫熒光觀察TGF-β1是否誘導(dǎo)KLF4和p300入核;Sequential-ChIP法檢測(cè)p300和KLF4在p21啟動(dòng)子上的結(jié)合方式;GST pull-down體外驗(yàn)證KLF4與p300、PTEN的相互作用。
　　結(jié)論:在基礎(chǔ)水平上，PT

7、EN與KLF4形成復(fù)合物抑制KLF4的磷酸化，TGF-β1刺激后，PTEN與KLF4解離，PTEN不再能去磷酸化KLF4，進(jìn)而KLF4轉(zhuǎn)為與p300相互作用，將募集p300到p21等分化相關(guān)基因的啟動(dòng)子KLF4結(jié)合位點(diǎn)上。
　　第三部分 磷酸化型KLF4通過p38信號(hào)通路影響p300乙?；M(jìn)而介導(dǎo)組蛋白H3乙?；?br>　　目的:研究KLF4的磷酸化修飾是否參與組蛋白H3的乙酰化及作用機(jī)制。
　　方法:轉(zhuǎn)染KLF4磷酸化、

8、乙?；稽c(diǎn)突變體表達(dá)質(zhì)粒，觀察與KLF4相互作用的相關(guān)蛋白的修飾狀態(tài)的改變;Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路的變化;siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)用于在VSMC中敲低KLF4;免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KLF4磷酸化和乙?；癄顟B(tài)的變化。
　　結(jié)果:1.KLF4磷酸化影響其與p300的相互作用及自身的乙?；?br>　　VSMC被TGF-β1刺激后，KLF4發(fā)生磷酸化在前，乙?；诤?磷酸化型KLF4影響KLF4與p300相互作用，但不影響KLF4

9、與PTEN的相互作用，這意味著KLF4與PTEN的解離在先，KLF4與p300相互作用在后。
　　2.KLF4的磷酸化影響組蛋白H3乙?；?br>　　上述結(jié)果顯示，過表達(dá)KLF4可增加組蛋白H3的乙?；?，那么是否KLF4的磷酸化也影響組蛋白乙?；?？我們分別用KLF4(WT)、KLF4(S470A)、KLF4(K225R)、KLF4(K229R)和KLF4(K225/229R)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot分析結(jié)果

10、顯示，轉(zhuǎn)染KLF4(WT)后，給予TGF-β1孵育12 h，組蛋白H3的乙?；矫黠@增高，在KLF4(S470A)轉(zhuǎn)染+TGF-β1處理的細(xì)胞中，乙?；虷3水平明顯降低。但是KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β1組的乙?；?jīng)]有受到影響。我們也檢測(cè)了p300對(duì)組蛋白H3乙?；挠绊?，用p300乙?；敢种苿〨arcinol孵育細(xì)胞后，乙酰化型H3水平

11、顯著降低。這些結(jié)果表明，KLF4磷酸化對(duì)組蛋白H3乙?；挠绊懞苡锌赡苁峭ㄟ^募集p300來實(shí)現(xiàn)的的。
　　3.KLF4磷酸化影響p300乙?；?br>　　Western blot分析結(jié)果顯示，TGF-β1作用于細(xì)胞15 min，PTEN的磷酸化顯著增加，在30 min達(dá)到高峰，60 min后PTEN的磷酸化恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，與KLF4的磷酸化變化趨勢(shì)一致。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，我們也檢測(cè)了p300乙?；揎棤顟B(tài)的變化。結(jié)果顯示，TGF-

12、β1刺激使p300乙?；匠蕰r(shí)間依賴性增加，與KLF4的乙?；兓厔?shì)一致。那么KLF4磷酸化是否影響p300乙酰化呢？轉(zhuǎn)染KLF4(WT)后，給予TGF-β1孵育30 min，PTEN的磷酸化和p300乙酰化水平均增高，KLF4(S470A)+TGF-β1使p300的乙酰化水平明顯降低，對(duì)PTEN的磷酸化沒有影響。而KLF4(K225R)+TGF-β1、KLF4(K229R)+TGF-β1和KLF4(K225/229R)+TGF-β

13、1處理對(duì)p300乙?；瘺]有影響?？梢姡琄LF4的磷酸化會(huì)正反饋調(diào)節(jié)p300的乙?；健?br>　　4.Smad和p38信號(hào)通路影響p300與KLF4的修飾狀態(tài)
　　我們進(jìn)一步檢測(cè)了TGF-β1對(duì)有關(guān)信號(hào)通路的影響。用TGF-β1刺激給予VSMC不同時(shí)間(0、15、30、45、60 min)，提取總蛋白進(jìn)行Western blot分析。結(jié)果顯示，TGF-β1可以誘導(dǎo)p38、JNK、Smad2和Akt的快速磷酸化，而ERK的磷酸化水

14、平降低。同時(shí)，而各組細(xì)胞中p38、JNK、Smad2、Akt和ERK的總量沒有發(fā)生變化。在給予TGF-β1處理細(xì)胞之前，用上述信號(hào)通路的特異性抑制劑預(yù)孵育細(xì)胞2h，經(jīng)免疫沉淀和Western blot分析各蛋白的翻譯后修飾狀態(tài)的改變。結(jié)果顯示，TGF-β1通過p38 MAPK和Akt信號(hào)通路影響PTEN的磷酸化;通過Smad和p38 MAPK信號(hào)通路影響KLF4的磷酸化、乙?；蚿300的乙?；?。證實(shí)TGF-β1通過Smad和p38 M

15、APK信號(hào)通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化是p300乙?；匦璧摹?br>　　5.KLF4通過p38信號(hào)通路影響p300乙?；?br>　　我們也檢測(cè)了KLF4影響p300乙?；男盘?hào)通路。Western blot結(jié)果顯示，KLF4過表達(dá)可增加p38的磷酸化，但是不影響Smad的磷酸化水平。敲低KLF4可以部分抑制p38的磷酸化。這就從正反兩方面證明了，KLF4可能通過p38信號(hào)通路促進(jìn)p300的乙?；?br>　　結(jié)論:TGF-β1通過激活p3

16、8和Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)KLF4磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)KLF4與p300相互作用及KLF4乙?；?。同時(shí)，KLF4也可通過間接激活p38信號(hào)通路誘導(dǎo)p300乙酰化，進(jìn)而促進(jìn)組蛋白H3的乙?；?br>　　結(jié)論:1.KLF4可以將p300募集到VSMC分化相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，并促進(jìn)介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的組蛋白H3乙酰化。
　　2.在基礎(chǔ)水平上，PTEN與KLF4形成復(fù)合物抑制KLF4的磷酸化，TGF-β1刺激后，PTEN與K