胚胎期造血細胞分化潛能分析與內皮祖細胞動員劑研究.pdf

1、第一部分：
　　哺乳動物造血的發(fā)生與發(fā)育是一個非常復雜的過程,具有嚴格的時空特異性,在胚胎發(fā)育過程中造血位點出現于不同的解剖部位,分別為原始造血和永久造血。原始造血最早是由出現于胚胎第7天(E7.0)的卵黃囊(YS)“血島”產生原始紅細胞,和成年人的紅血胞在大小形狀、基因表型、細胞激素需求上有差別。但永久造血起源于何處仍存在爭議,目前主流認為胚胎初生造血干細胞(HSCs)是多個造血位點共同起源,即卵黃囊和胚體的P-Sp/AGM區(qū),

2、還有認為尿囊和胎盤也可能是發(fā)生部位,隨后遷移至胎肝大量擴增。研究表明卵黃囊也可產生永久造血干/祖細胞,但由于微環(huán)境和其他可能的原因,卵黃囊來源的造血干/祖細胞自我更新能力弱,分化能力強,數量迅速減少。因此,卵黃囊造血表現為胚胎發(fā)育過程中第一波的短暫性造血,并不是隨后發(fā)生的胎肝和骨髓造血的主要來源。近期的一系列研究表明,在E8.25的卵黃囊造血中可以檢測出胚胎發(fā)育過程中第一波的一過性造血,隨著循環(huán)系統(tǒng)的形成,在胚體其他部位也出現造血細胞,

3、E8.5的主動脈旁臟層(P-Sp)也出現一波短暫性造血;真正具有長期重建各系造血功能的HSC出現在E10.0的胚內AGM區(qū),并且進一步定位在其中的背主動脈(dorsalaorta,DA)。隨后,在胚胎其他的大血管,如卵黃囊動脈以及臍動脈中也發(fā)現有造血前體細胞,而且在上述動脈管壁內可見造血細胞簇。由于血液循環(huán)系統(tǒng)的建立,定位胚胎期產生的造血干細胞的發(fā)生位點是個非常復雜的過程,在研究中,使用合適的胚胎期造血細胞的標志成為研究的關鍵點之一。<

4、br>　　CD41,又稱αIIb整合素,是眾所周知的巨核細胞和血小板的特異性標志,最近研究發(fā)現在小鼠胚胎發(fā)育過程中CD41的表達標志著原始造血和永久造血的啟動發(fā)生,并且胚胎發(fā)育過程中CD41在YS“血島”,AGM區(qū)和胎盤中都有階段性表達。內皮細胞、造血細胞和間質細胞在發(fā)育過程中關系密切,目前的研究報道主要集中在CD41+細胞向造血分化潛能的研究,然而,小鼠胚胎時期CD41+細胞除造血之外的多向分化潛能尚未闡明清晰。因此,我們擬通過流式細

5、胞儀分選胚胎11.0天(E11.0)的AGM區(qū),卵黃囊和胚胎循環(huán)血(CB)中的CD41+細胞,并研究其向間質細胞分化的潛能,為研究胚胎造血發(fā)育調控奠定良好的基礎。首先我們在體外半固體培養(yǎng)基中進行CD41+細胞造血分化潛能研究,AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41+細胞生成造血各譜系的能力有一定差異;隨后主要在體內外研究了CD41+細胞向間質細胞分化的潛能:(1)體外建立間質細胞誘導體系,探討小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的CD

6、41+細胞向間質細胞分化潛能;(2)建立一個體內評價CD41+細胞向間質細胞分化的動物模型,分選GFP轉基因小鼠胚胎發(fā)育過程中AGM區(qū)、YS和CB來源的GFP+CD41+細胞進行體內移植,通過免疫熒光檢測間質細胞分化標志vimentin、α-SMA、epimorphin(EPM)的表達情況來評估其向間質細胞分化能力;(3)根據CD41表達強弱分析和探討CD41+細胞中具有間質細胞分化潛能的細胞亞群。我們體外實驗發(fā)現,AGM區(qū)的CD41+

7、細胞形成的貼壁的成纖維樣間質細胞增殖能力較強,至少能擴增5-6代;YS來源的CD41+細胞也能生成貼壁的成纖維樣間質細胞,但其只能擴增1-2代,增殖能力較弱;CB來源的CD41+細胞只有很少一部分能生成貼壁的成纖維樣間質細胞,大多都是圓形不貼壁的造血細胞。免疫熒光結果表明,無論AGM區(qū)還是YS來源的成纖維樣間質細胞都表達成纖維母細胞標志vimentin和α-SMA,而CB中只有極少量的甚至無vimentin和α-SMA的表達。體內實驗通

8、過建立半致死劑量輻射損傷小鼠模型,移植GFP+CD41+細胞后,從第二周開始直至第四周,檢測受體小鼠外周血中GFP表達情況,發(fā)現AGM區(qū)來源的GFP+CD41+細胞造血重建能力遠遠強于YS和CB來源的GFP+CD41+細胞,YS來源的GFP+CD41+細胞呈現短暫性造血重建;檢測受體骨髓中GFP+CD45+嵌合情況,發(fā)現AGM區(qū)來源的GFP+CD41+細胞能歸巢到受體骨髓進行造血重建,而YS和CB來源的GFP+CD41+細胞很少歸巢至骨

9、髓。與此同時,我們在AGM區(qū)和YS來源的GFP+CD41+細胞移植組小鼠肺部切片中發(fā)現有GFP+細胞,并沿著血管外周形成管腔樣結構,對這些GFP+細胞的進一步鑒定表明其表達間質細胞標志vimentin/α-SMA/EPM,并還檢測到有少部分細胞表達造血/內皮細胞標志CD31+,而在CB來源的GFP+CD41+細胞移植小鼠肺部并沒有發(fā)現GFP+細胞的分布。為了進一步確定CD41+細胞中具有間質分化潛能的細胞亞群,我們根據CD41表達強弱,

10、流式分選出AGM區(qū)和YS來源的CD41int和CD41high亞群進行體外間質細胞誘導分化,研究表明AGM區(qū)和YS來源的CD41+細胞中具有間質細胞分化潛能的一群細胞主要在CD41int中。隨后又對AGM區(qū)和YS來源的CD41int做了進一步鑒定研究,聯合利用CD34標志雙色分選出CD41intCD34-和CD41intCD34+細胞,發(fā)現AGM區(qū)來源CD41intCD34-細胞具有間質細胞分化能力,而CD41intCD34+細胞未觀察

11、到間質分化潛能;YS來源CD41intCD34-細胞和CD41intCD34+細胞都具有間質細胞分化潛能。
　　綜上所述,我們的研究初步表明:(1)AGM區(qū)、YS和CB來源的CD41+細胞體外除了能向造血各譜系分化外,在體內外一定條件下,還能向間質細胞分化,且AGM區(qū)來源的CD41+細胞形成的間質細胞增殖能力遠遠強于YS和CB來源的CD41+細胞。(2)體內移植實驗中,只有AGM區(qū)和YS來源的CD41+具有間質分化能力,且AGM區(qū)

12、來源的CD41+細胞造血重建能力強于YS和CB來源的CD41+細胞。(3)AGM區(qū)和YS來源的CD41+細胞中具有間質細胞分化潛能的一群細胞主要在CD41int中。聯用CD34標志雙標分選出CD41intCD34-和CD41intCD34+細胞中,AGM區(qū)來源的CD41intCD34-細胞具有間質細胞分化能力,而CD41intCD34+細胞未觀察到;YS來源的CD41intCD34-細胞和CD41intCD34+細胞都具有間質細胞分化潛

13、能。
　　第二部分:
　　缺血性疾病是一類嚴重威脅人類健康和生存質量的疾病,包括心腦血管缺血和嚴重肢體缺血損傷。目前,臨床治療手段主要包括藥物治療、血管旁路重建、血管腔內成形或支架術等,治療方法無實質性改進,療效也不理想?！爸委熜匝苄律?therapeutic neovascularization)的提出為缺血性疾病的治療提出新策略,應用內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)植入

14、術可促進缺血組織的血管新生和側枝循環(huán)形成,增強血流灌注,治療缺血性疾病。外周血中EPCs是同時表達Sca-1和Flk-1表面標志的一群可向血管內皮分化的高增殖潛能前體細胞,可替代凋亡或壞死的內皮細胞,參與損傷后的血管新生。通過外源性移植EPCs可促進缺血心肌和肢體骨骼肌血管的新生。近年來的研究發(fā)現干細胞動員藥物對治療缺血性疾病有一定的療效,可動員自體骨髓中的干細胞到損傷組織,促進血管新生、恢復缺血組織功能,為缺血性疾病的治療提供了新的思

15、路。
　　干細胞動員過程復雜,SDF-1α/CXCR4軸在骨髓干細胞的遷移與歸巢中發(fā)揮重要的作用。SDF-1α的趨化作用由其受體CXCR4介導。骨髓中HSCs和EPCs高表達CXCR4,基質細胞分泌SDF-1α對此類細胞具有趨化作用。干細胞歸巢與動員是個互為鏡像的動態(tài)過程。通過擾動SDF-1α/CXCR4軸可大量動員骨髓干細胞進入外周血。缺血、缺氧及組織損傷等病理變化均可使缺血損傷組織SDF-1α的分泌顯著增強,形成SDF-1α濃

16、度梯度差,骨髓中高表達CXCR4的EPCs能夠沿著SDF-1α的濃度梯度遷移至損傷部位參與修復。但正常外周血中EPCs數量很低,這種代償性的EPCs動員過程不足以用來修復損傷組織,通過干細胞動員藥物則能打破這一限制,大量動員骨髓中EPCs并遷移至缺血組織,促進血管新生,恢復缺血組織功能。目前研究發(fā)現的細胞因子包括G-CSF,GM-CSF,VEGF和雌二醇(estradiol),CXCR4拮抗劑AMD3100,及一氧化氮(NO)和血管生成

17、素(angiopoietin)均可不同程度動員骨髓干細胞進入外周血。這些干細胞動員劑對內皮祖細胞的動員效果及促進缺血組織恢復的能力還需進一步改進,部分動員劑反復給藥會引發(fā)副作用。因此,研發(fā)新型、高效、無毒副作用的干細胞動員劑成為研究和開發(fā)的熱點。
　　本研究中,我們首次研究發(fā)現了一種飽和胺類小分子化合物Me6可持續(xù)大量動員EPCs,促進缺血組織血管的新生,對下肢缺血性疾病的修復具有一定的作用。我們研究證明Me6皮下給藥后小鼠的外周

18、血和脾臟中Sca-1+Flk-1+細胞含量均顯著增加。Me6在給藥12h后的通過流式檢測顯示外周血中內皮祖細胞Sca-1+Flk-1+比例是正常血中的3倍(Me61.98±0.13％vs.vehicle control 0.71±0.09%),統(tǒng)計分析與對照組間存在顯著性差異(**p<0.01),直至72h后外周血中Sca-1+Flk-1+比例恢復正常。脾臟具有募集內皮祖細胞的功能,同時在此作用時間點,脾臟中這群Sca-1+Flk-1+

19、細胞(Me67.33±0.71%vs.vehiclecontrol3.3±0.37%)的比例也上調,統(tǒng)計數據與正常對照組的脾臟中內皮祖細胞數量具有統(tǒng)計學意義(**p<0.01)。流式檢測外周血還發(fā)現Me6還能顯著上調CD34的表達(Me619.5±1.4vs.vehicle control 14.8±0.76),而間充質干細胞相關標志并沒有明顯變化,CD29有輕微上調,CD105沒有變化。
　　為進一步評估Me6動員的EPCs促進

20、缺血下肢損傷修復的功能,我們建立了小鼠下肢缺血模型,將Me6或PBS處理小鼠的外周血單個核細胞移植到小鼠下肢缺血損傷肌肉組織中,應用激光多普勒(LDPI)指數(由缺血下肢與正常下肢之比值來計算)經行評估血流灌注恢復效果。結果發(fā)現移植了Me6給藥小鼠的外周血細胞能明顯促進缺血下肢血流灌注的恢復。我們進一步觀察了Me6對下肢缺血損傷小鼠的EPCs動員效果。建立小鼠下肢缺血模型在第7天給藥檢測各組外周血中Sca-1+Flk-1+比例(Me63

21、.09±0.5%;AMD31003.17±0.4%;vehicle control 1.49±0.1%),發(fā)現結果表明Me6能有效動員下肢缺血損傷小鼠骨髓中的EPCs至外周血中。進一步研究結果證明Me6能直接動員自體骨髓中的EPCs進入外周血,進而被募集到缺血損失組織,分化為血管內皮參與血管新生。對下肢缺血損傷小鼠皮下注射Me6后的治療效果觀察中發(fā)現,經Me6治療的小鼠,其缺血損傷的下肢血流灌注得到了很好的恢復,新生血管數量顯著高于對照