鈣離子激活的鉀離子通道在人子宮內膜蛋白水平的表達及其功能研究.pdf

1、背景 鈣離子激活的鉀通道(KCa)是一類重要的鉀離子通道家族,他們能直接介導鈣離子信號的傳導,改變膜電位,影響細胞的增殖分化.許多細胞都表達KCa,它的重要功能在于受到細胞內第二信使鈣離子的影響,改變鉀離子的跨膜轉運,最終改變膜電位.目前根據(jù)他們不同生理、藥理特征,以及基因序列的差異,鑒定出三種KCa亞家族.KCa根據(jù)其電導的大小分為大電導KCa(Large-conductancecalcium-activated potass

2、ium channel BKCa); 中電導KCa(Intermediate-conductance calcium-activated potassium channel, IKCa)和小電導KCa(Small-conductance calcium-activated potassium channel,SKCa)三類.三種KCa通道都受到細胞內鈣離子的調節(jié),但是它們分布在不同的組織,具有不同的功能.BKCa在血管血流的肌源性調節(jié)中

3、起著重要作用:IKCa在許多腫瘤細胞的生長調控中起著重要作用;SKCa在神經系統(tǒng)有著豐富的表達,調控大量神經遞質的釋放. 胚胎著床是人類生命形成和持續(xù)發(fā)育的最關鍵步驟,但到目前為止,胚胎著床的具體機制還不清楚,近年來有關通道蛋白在子宮內膜中的作用及其與胚胎著床和生長發(fā)育的關系已逐漸成為生殖研究領域的新焦點.目前包括Cl離子通道,Na<'+>離子通道,Ca<'+>離子通道及非離子通道的水通道(Aquaporins)在子宮內膜中的表

4、達,分布和功能的研究已在國內外多家研究室深入展開.2003年NatureCell Biol發(fā)表論文闡明人纖維囊性病患者不孕是與子宮內膜細胞C1<'->離子通道功能降低,導致HCO<,3><'->分泌減少相關.2006年,首次報道新型通道蛋白-2型水通道(aquaporin 2)在人子宮內膜細胞上表達,并闡明了其分布特點及調節(jié)機制.我們知道鈣離子在多種細胞中都發(fā)揮的重要作用,包括子宮內膜細胞,但是子宮國家自然科學基金資助項目(305707

5、89)內膜細胞是否表達KCa至今未見任何報道. 本研究采用western blot方法檢測了BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白是否表達于人的子宮內膜細胞,并分析比較三種通道蛋白在增生期和分泌中期的表達差異,推測三種通道在月經周期中所起的作用;同時采用MTT方法,檢測分別在IKCa、SK3的特異性抑制劑的作用下,子宮內膜的生長狀態(tài),以了解這些通道對子宮內膜細胞的增殖所起的作用. 材料與方法 1.選取管性不孕

6、擬接受體外受精一胚胎移植(IVF-ET)治療的婦女,于IVF-ET前一周期行宮腔探查時(體溫升高后第5-6天)取子宮內膜作為分泌中期標本(n=16);另取因子宮肌瘤行經腹子宮次全切除(月經周期第8-10d)子宮內膜作為增生期內膜(n=14),分別采用Western blot方法進行膜蛋白BKCa、IKCa、SKCa (SK3)檢測,對wes tern b10t結果進行半定量分析. 2.我院因子宮肌瘤行經腹子宮次全切除的婦女4例,

7、在離體子宮內膜細胞培養(yǎng)基礎上,用MTT法測定在E<,2>、IKCa的抑制劑Tram-34和SKCa的抑制劑Apamin作用下,子宮內膜其活性的變化.以未加藥組的子宮內膜做對照,分別測定作用時間24h,48h,72h,96h后的OD值,繪制生長曲線,選取加藥后96小時的OD平均值,進行各組間數(shù)據(jù)比較分析. 采用單因素方差(One-Way ANOVA)、Tukey、t檢驗的統(tǒng)計學方法進行多組和兩組間數(shù)據(jù)比較分析,檢驗水準α=0.05

8、,雙側.所有實驗數(shù)據(jù)用SPSSl3.0統(tǒng)計軟件包進行處理. 結果 1.BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白在人的子宮內膜的增生期和分泌期均有表達 2.BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白在人的子宮內膜的相對表達量BKCa在人的子宮內膜增生期的相對表達量為0.43±0.05,分泌中期的相對表達量為1.24±0.12,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨立樣本t檢驗,p<0.01,差異具有統(tǒng)計學意義,分泌

9、中期的表達明顯高于增生期;IKCa在人的子宮內膜增生期的相對表達量為4.45±0.70,分泌中期的相對表達量為0.95±0.15,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨立樣本t檢驗,p<0.01,差異具有統(tǒng)計學意義,增生期的相對表達量明顯高于分泌中期;SKCa(SK3)在人的子宮內膜增生期的相對表達量為4.80±0.76,分泌中期的相對表達量為0.98±0.25,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨立樣本t檢驗,p<0.01,差異具有統(tǒng)計

10、學意義,增生期的相對表達量明顯高于分泌中期. 3.IKCa的抑制劑Tram-34和SKCa(SK3)的抑制劑Apamin分別對子宮內膜細胞增殖的影響本研究所采用不同的藥物與子宮內膜共培養(yǎng)24h,48h,72h,96h后對其活性分析,至加藥后72h,子宮內膜細胞在抑制劑的作用下生長減慢.E<,2>作用24h,48h,72h,96h后子宮內膜細胞的吸光度OD值分別為:0.27±0.03,0.38±0.04,0.58±0.05,0.6

11、3±0.04;Tram-34作用24h,48h,72h,96h后子宮內膜細胞的OD值分別為:0.26±0.01,0.33±0.4,0.34±0.04,0.34±0.04;Apamin作用24h,48h,72h,96h后子宮內膜細胞的OD值分別為:0.26±0.02,0.32±0.03,0.38±0.04,0.45±0.03;對照組作用24h,48h,72h,96h后子宮內膜細胞的OD值分別為:0.27±0.03,0.33±0.05,0.

12、40±0.05,0.49±0.03.對于加藥96h后各組0D值分別為對照組0.49±0.03,雌激素組0.63±0.04,lumol/LTram-34組0.34±0.04,lumol/L Apamin組0.45±0.03采用One-way ANOVA、tukey統(tǒng)計學方法進行各組間數(shù)據(jù)比較分析.統(tǒng)計學分析Tram-34組明顯低于對照組(p<0.05)和雌激素組(p<0.01),Apamin組明顯低于雌激素組(p<0.01),其它各組之間

13、無統(tǒng)計學差異. 結論 1.KCa在人的子宮內膜細胞上有周期性的表達,是人子宮內膜細胞的重要的離子通道之一. 2.BKCa在分泌中期的表達明顯高于增生期,推測BKCa可能參與雌孕激素誘導的人子宮內膜細胞分泌中期相關因子的合成與釋放. 3.IKCa在增生期的表達明顯高于分泌中期,且IKCa的抑制劑Tram-34對子宮內膜細胞的生長具有抑制作用,推測IKCa可能參與了子宮內膜細胞的增殖的調控.4.SKCa在增生