日本血吸蟲(chóng)復(fù)合B細(xì)胞表位抗原的研究.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病。我國(guó)是全球血吸蟲(chóng)病危害最嚴(yán)重的國(guó)家(埃及、蘇丹、中國(guó)、巴西)之一，我國(guó)流行日本血吸蟲(chóng)病，主要流行于長(zhǎng)江流域及以南的12個(gè)省(市、自治區(qū))的434個(gè)縣（市、區(qū)），受威脅的人口約2億。經(jīng)50多年防治血吸蟲(chóng)病的不懈努力，我國(guó)血吸蟲(chóng)病防治工作已取得了巨大的成績(jī)。但目前全國(guó)仍有109個(gè)縣（市、區(qū)）有血吸蟲(chóng)病流行，病人數(shù)達(dá)84.25萬(wàn)，病畜約2.41萬(wàn)頭。 血吸蟲(chóng)病的診斷在血吸蟲(chóng)病防治中起著

2、極為重要的作用。隨著血吸蟲(chóng)病防治措施的實(shí)施，流行區(qū)的感染度和感染率明顯下降，以至血吸蟲(chóng)病經(jīng)典的寄生蟲(chóng)學(xué)診斷方法－糞檢的敏感性明顯下降，并且由于糞便檢查費(fèi)工、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，疫區(qū)群眾的依從性逐年下降，這種經(jīng)典的寄生蟲(chóng)學(xué)診斷技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)大規(guī)模查病中的應(yīng)用受到很大的限制。由于免疫診斷技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、敏感性較高、特異性較好等優(yōu)點(diǎn)，因此發(fā)展免疫學(xué)診斷方法來(lái)代替或補(bǔ)充糞檢為廣大專業(yè)人員所采納。常用的免疫學(xué)診斷方法所采用的檢測(cè)抗原多為血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)或蟲(chóng)卵抗原

3、，這些抗原成分復(fù)雜且成本較高；而用基因工程方法制備完整的抗原雖可以獲得較純的抗原，但常常由于表達(dá)效率不高或純化困難，因而限制了其的廣泛應(yīng)用。因此，人們迫切希望獲得針對(duì)性強(qiáng)、診斷效率又高，并容易制備的抗原，以代替復(fù)雜的粗抗原或全長(zhǎng)的分子抗原，使診斷更具有針對(duì)性，在保證抗原敏感性較高的前提下更進(jìn)一步提高其特異性。 表位，又稱抗原決定簇，是指免疫應(yīng)答中被特異的效應(yīng)分子或T、B淋巴細(xì)胞識(shí)別的抗原分子上的特定結(jié)構(gòu)位點(diǎn)。B細(xì)胞表位是指抗原中

4、可被B細(xì)胞抗原受體（BCR）或抗體特異性識(shí)別并相互結(jié)合的線性片斷或空間構(gòu)象型結(jié)構(gòu)。B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)對(duì)于免疫原性多肽的設(shè)計(jì)、新型疫苗分子的設(shè)計(jì)都有很大的幫助，并且有利于診斷試劑的開(kāi)發(fā)以及臨床疾病的預(yù)防與診斷。近年來(lái)，隨著免疫學(xué)理論、蛋白質(zhì)工程技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)技術(shù)、計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們對(duì)B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)的研究方法和思維方法有了新的進(jìn)展。隨著對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的研究認(rèn)識(shí)，B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)得到了進(jìn)一步的發(fā)展。但以一種抗原分

5、子或者單一的表位抗原用于血吸蟲(chóng)病診斷的敏感性和特異性是有限的，所以我們?cè)O(shè)想采用多個(gè)抗原分子或者多個(gè)抗原的B細(xì)胞表位的復(fù)合，發(fā)展復(fù)合表位抗原，用于血吸蟲(chóng)病的免疫診斷。 本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)軟件BioSun分析在具有診斷潛能的四個(gè)日本血吸蟲(chóng)候選分子即日本血吸蟲(chóng)22.6 kDa膜蛋白（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信號(hào)蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Sj26）中預(yù)測(cè)出相關(guān)的B細(xì)胞表位，采用分

6、子生物學(xué)方法通過(guò)原核表達(dá)及純化，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot鑒定，獲得可被血吸蟲(chóng)病人血清識(shí)別的表位抗原片斷。通過(guò)隨機(jī)順序法連接相關(guān)候選表位，構(gòu)建復(fù)合B細(xì)胞表位表達(dá)得到融合蛋白，再次通過(guò)Western blot證實(shí)其抗原性。進(jìn)一步通過(guò)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用以評(píng)估該復(fù)合B細(xì)胞表位抗原用于血吸蟲(chóng)病免疫診斷的應(yīng)用價(jià)值。 第一部分：日本血吸蟲(chóng)診斷分子B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)、構(gòu)建、 表達(dá)和純化 根據(jù)日本血吸蟲(chóng)中具有診斷潛能的四個(gè)候選分子即

7、日本血吸蟲(chóng)膜蛋白22.6 kDa（Sj22.6）、23 kDa膜蛋白（Sj23）、信號(hào)蛋白14-3-3(Sj14-3-3)和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（Sj26）的氨基酸序列，用生物信息學(xué)軟件BioSun分析和預(yù)測(cè)其B細(xì)胞表位，確定了8個(gè)候選表位（每個(gè)分子中選擇2個(gè)表位片斷）。設(shè)計(jì)并合成目的表位的編碼核苷酸，克隆入高效融合表達(dá)載體pET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，得到重組質(zhì)粒，用酶切法及測(cè)序法鑒定。酶切和測(cè)序結(jié)果顯示重組成功。

8、陽(yáng)性克隆經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物用Ni2＋-NTT柱純化并在PBS中透析，獲得了大量的可溶性候選表位融合蛋白，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示為單一條帶。經(jīng)Western blot檢測(cè)，P1～P8這8個(gè)目的蛋白中僅有P2（來(lái)自Sj22.6）、P6（來(lái)自Sj14-3-3）、P7（來(lái)自Sj26）可與血吸蟲(chóng)病人陽(yáng)性血清反應(yīng)而與健康人血清無(wú)反應(yīng)，其余5個(gè)目的蛋白與血吸蟲(chóng)病人血清和健康人血清均無(wú)反應(yīng)。表明這3條目的蛋白片斷可

9、能為具有潛在診斷價(jià)值的B細(xì)胞表位。 第二部分 日本血吸蟲(chóng)復(fù)合B細(xì)胞表位診斷分子的 構(gòu)建與鑒定 鑒于一種抗原分子或者單一的抗原表位用于血吸蟲(chóng)病診斷的敏感性和特異性常常非常有限，我們?cè)O(shè)想采用多種抗原的B細(xì)胞表位的復(fù)合，構(gòu)建復(fù)合B細(xì)胞表位診斷分子，以達(dá)到提高診斷血吸蟲(chóng)病效能作用。 根據(jù)上一個(gè)實(shí)驗(yàn)得到的三條B細(xì)胞表位片斷P2（來(lái)自Sj22.6）、P6（來(lái)自Sj14-3-3）、P7（來(lái)自Sj26），用隨機(jī)順序法連

10、接這三個(gè)候選B細(xì)胞表位片斷，得到P2-P6-P7和P6-P2-P7這2個(gè)片斷，并分別重組入高效融合表達(dá)載體pET-32c(+)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切法和DNA測(cè)序鑒定獲得重組質(zhì)粒。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，這2個(gè)質(zhì)粒均可表達(dá)分子量約20.4KDa的融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物用Ni2＋-NTT柱純化并在PBS中透析，12％聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）顯示單一條帶。抗原性鑒定結(jié)果顯示這2個(gè)重組復(fù)合表位蛋白均可被日本血吸蟲(chóng)病人血

11、清識(shí)別，而不與健康人血清反應(yīng)，表明其具有診斷血吸蟲(chóng)病的潛能，為應(yīng)用復(fù)合表位抗原診斷血吸蟲(chóng)病的研究奠定了基礎(chǔ)。 第三部分 重組復(fù)合B細(xì)胞表位抗原用于血吸蟲(chóng)病 診斷的初步研究 用純化的重組日本血吸蟲(chóng)診斷分子復(fù)合B細(xì)胞表位抗原作為檢測(cè)抗原，建立間接ELISA方法，檢測(cè)日本血吸蟲(chóng)感染者血清和非血吸蟲(chóng)病流行區(qū)健康者血清，以及肝吸蟲(chóng)和肺吸蟲(chóng)病人血清，并與可溶性蟲(chóng)卵抗原（SEA）進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)該抗原用于血吸蟲(chóng)病免疫診斷的

12、應(yīng)用價(jià)值。 通過(guò)正交試驗(yàn)，獲得了采用重組復(fù)合表位抗原CZ-1進(jìn)行間接ELISA的最佳檢測(cè)條件：重組抗原的包被濃度為10μg/ml，血清稀釋度為1：200，酶標(biāo)記的羊抗人IgG為1：1000。檢測(cè)50份慢性血吸蟲(chóng)病感染者血清，均為陽(yáng)性反應(yīng)，敏感性達(dá)到100％；40份來(lái)自非血吸蟲(chóng)病流行區(qū)健康人血清，未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。與相同條件下以SEA為抗原的檢測(cè)結(jié)果相比較，結(jié)果相同。但檢測(cè)15份肝吸蟲(chóng)病人血清，應(yīng)用CZ-1抗原有1份（7％）陽(yáng)性，SE