樹突狀細胞基因表達與動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定關(guān)系的研究.pdf

1、冠心病(coronary heart disease，CHD)作為進入二十世紀以來，威脅人類生命健康的主要疾病，其有效防治一直成為整個社會關(guān)注的重點和難點。 本文就樹突狀細胞基因表達與動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定關(guān)系進行了研究，全文分為三個部分，將分離的臨床病例外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和血清為研究對象，以研究外周血PBMC源性DCs基因表達和功能變化是否介入冠心病發(fā)

2、生發(fā)展為切入點，通過免疫熒光、流式細胞術(shù)、基因芯片、RT-PCR和ELISA等方法，重點觀察外周血PBMC源性DCs的成熟，狀態(tài)、免疫功能和其他基因表達的差異與AS發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，深入探討抗原呈遞細胞功能變化在AS演變不同階段的地位和作用。旨在為AS發(fā)生發(fā)展的免疫介導(dǎo)學(xué)說提供實驗依據(jù)和免疫治療途徑，為心腦血管疾病的防治提供新的理論平臺和技術(shù)手段，具有長遠的經(jīng)濟價值和重要的社會意義。結(jié)果分述如下： 1．ACS患者外周血來源的DCs

3、處于成熟狀態(tài)，并具有誘導(dǎo)T細胞增殖的能力1．1各組患者一般臨床資料情況比較無顯著性差異臨床入選病例總共81例，其中AMI組20例、UAP組20例、SAP組20例、CPS組11例、對照組10例)一般臨床資料的比較顯示：各組的年齡、性別比例相比差異無顯著性意義(P>0.05)。各組中主要的心血管病危險因素，如：吸煙(Smolking)、高血壓(Hypertension)、糖尿病(Diabetes mellitus)、總膽固醇(Total c

4、holester01)、甘油三脂(Triglyceride)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL cholesterol)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL cholesterol)等，相互之間的比較差異無顯著性意義(P>0.05)； 1．2體外誘導(dǎo)PBMC來源的DCs，流式細胞儀鑒定DCs細胞表型： 倒置相差顯微鏡下的形態(tài)：培養(yǎng)第3天可見細胞貼壁生長，由圓形變?yōu)椴灰?guī)則形，并長出一些小刺狀結(jié)構(gòu)，細胞質(zhì)變得豐富。培養(yǎng)第5天，樹突樣結(jié)構(gòu)更

5、加明顯，胞質(zhì)更加豐富，細胞逐漸懸浮或半貼壁。培養(yǎng)到7天后，細胞形態(tài)無明顯改變，細胞開始聚集成細胞團，大部分懸浮或半貼壁，少數(shù)貼壁。臺盼藍染色細胞活力大于96％。流式細胞儀檢測人外周血PBMC來源的DCs表型為CD1α<'+>，CD80<'+>，CD83<'low>，CD86<'+>，HLA-DR<'+>； 1．3與自身血漿共同培養(yǎng)DCs上清液細胞因子IL-12檢測結(jié)果： 正常對照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組

6、上清液的IL-12表達量12小時樣本測的分別為19.46±6.83，27.964±9.16，24.234±7.72，59.9±24.00和68.5±16.5pg/ml，24小時樣本測的分別為45.84±17.64，49.04±16.62，52.1±16.55，129.41±46.60和130.86±30.68pg/ml和48小時測的分別為50.68±16.7，59.93±16.37，57.84±16.36，151.43±43.79和15

7、3.95±27pg/ml，IL-12在五組間差異有顯著性意義(均P<0.001)。LSD比較分析表明，UAP組和AMI組比正常對照組、CPS組和SAP組DCs上清培養(yǎng)液中IL-12濃度在12小時、24小時和48小時都升高； 1．4各組DCs與自身血漿共孵育后FACS分析DCs表型變化情況： 正常對照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組PBMC來源的DCs細胞表面CD1α表達比例分別為11.084±3.82％，12.

8、28+3.91％，13.71+5.53％，20.09+4.9％和20.57+4.75％。CD80比例分別46.784±16.86％，48.51±14.75％，46.81±15.92％，61.39±11.49％和60.91±17.77％。CD83比例分別為47.57±12.34％，46.59±10.22％，45.76±14.11％，54.17±16.41％和51.31±18.8％。CD86比例分別為46.83±7.45％，46.08±10

9、.25％，45.76±17.75％，62.27±14.01％和67.98±17.03％。HLA-DR比例分別為79.01±11.05％，73.77±13.55％，72.16±17.11％，74.13±12.27％和79.23±9.79％。其中，CD1α、CD80和CD86等表型五組間比較差異有顯著性意義(F<,CD1>=13.4、F<,CD80>=4.138和F<,CD86>=8.672，均P<0.05)。LSD比較分析表明，UAP組和

10、AMI組比正常對照組、CPS組和SAP組CD1α、CD80和CD86表型表達細胞比例增加(均P<0.05)； 1．5各組患者DCs的同種混合淋巴細胞反應(yīng)： 正常對照組、CPS組、SAP組、UAP組和AMI組PBMC來源的DCs細胞與同種T淋巴細胞共孵育，在DCs細胞數(shù)與T細胞比例為1∶50時各組<'3>H-TDR摻入率分別為1035.8±280.9，1054±247.39，1112.4±319.9、2633.6±426.

11、1和2660.4±316.02cpm/2000cells；在DCs細胞數(shù)與T細胞比例為1∶20時各組<,3>H-TDR摻入率分別為2043.8±303.5，2169.55±311.6，2139±295.1、5122.3±640.4和5069.1±748.9cpm/2000cells。<'3>H-TDR摻入率在五組間存在顯著性差異(F<,1∶50>=110.06和F<,1∶20>=155.2，P<0.001)。LSD比較分析表明，UAP組

12、和AMI組在<'3>H-TDR摻入率較其他三組差異有顯著性意義(P<0.001)；而正常對照組、CPS組和SAP組之間<'3>H-TDR摻入率差異無顯著性意義(P>0.05)；而且，DCs在與T淋巴細胞1∶50混合時UAP組和AMI組<'3>H-TDR摻入率都明顯增加； 2．基因芯片檢測外周血PBMC來源的DCs基因表達不同 芯片檢測的結(jié)果顯示，ACS患者組功能蛋白表達基因中有5個基因呈明顯上升，分別是G1P2、G1P3

13、、IFIT4、IL-1β和MX1，這些都是高度相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)蛋白基因。有17個基因呈明顯下降表達，分別是ACPP、AIM2、ATM、CCR1，CCR5，CD1C，F(xiàn)CGR3A，IF116、IL-16，IL-18、LY75、MAP4K3，TAP1，TAP2、TLRl、TNFRSF6和VCL等，分別屬于抗原識別受體、細胞趨化因子受體、細胞因子和細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。如前所述，成熟的樹突狀細胞其抗原識別和攝取功能下降，而抗原提呈功能增強；最初

14、為有關(guān)抗原加工的亞細胞結(jié)構(gòu)蛋白的表達減少；而與抗原呈遞相關(guān)的蛋白表達應(yīng)該增多。我們的研究表明ACS患者外周血PBMC來源的DCs分別在抗原識別方面的受體如TLR1和FCGR3A等表達減低；而負責(zé)傳輸特異性抗原肽結(jié)合到MHC分子的TAP1和TAP2蛋白基因表達也同樣下降；而CCR1和CCR5這兩個趨化因子受體同樣是具有趨化DCs遷徙到抗原所在區(qū)域的作用，在DCs成熟時則表達下降；而與細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)高度相關(guān)的蛋白(如：MAP4K3)和某

15、些細胞因子(如：IL-16和IL-18基因)表達下降則可能與DCs細胞信號自身傳導(dǎo)和細胞間信號傳導(dǎo)變化相關(guān)。 3．熒光定量PCR檢測基因芯片結(jié)果，顯示DCs基因芯片檢測有較好的可信度 應(yīng)用熒光定量PCR檢測芯片檢測表達上調(diào)的基因MX1和IL-1β，以及表達下調(diào)的基因FIF16表達情況顯示，ACS患者MX1和IL-1β基因表達較對照組增加幅度與基因芯片檢測相似；而：FIF16基因表達較對照組降低加幅度與基因芯片檢測相似。

16、 通過上述三個部分的實驗，能夠得出以下結(jié)論：①ACS患者外周血PBMC源的DCs細胞表型表達處于成熟狀態(tài)，ACS患者體：DCs處于成熟活化狀態(tài)；②ACS患者外周PBMC來源的DCs，分泌IL-12水平較對照組明顯升高，且具有誘導(dǎo)同種T淋巴細胞增殖的能力；③ACS患者組功能蛋白表達基因中有5個基因呈明顯上升，分別是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1，這些都是高度相關(guān)的干擾素誘導(dǎo)蛋白基因。有17個基因呈明顯下降表達，分