ETV1在胃腸道間質瘤中的表達及致瘤調控機制研究.pdf

1、背景：
　　胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是消化系統(tǒng)最常見的間葉源性腫瘤，占胃腸道腫瘤的1％-4％。在人群中，GIST的發(fā)病率約為1/10萬-2/10萬人，近年來呈明顯增加趨勢。目前多認為GIST起源于胃腸道起搏細胞Cajal間質細胞(interstitial cells of Cajal，ICC)或其前體細胞。大部分GIST的發(fā)生與C-Kit(85％)和PDGFRA(10

2、％)基因發(fā)生功能獲得性突變有關。手術切除是GIST首選的治療方式，但術后腫瘤復發(fā)轉移率高達55％～90％，不能切除者中位生存期小于12個月，傳統(tǒng)的放化療對GIST基本無效。小分子酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼(imatinib)靶向作用于KIT和PDGFRA治療轉移性和復發(fā)性GIST已取得明顯療效，但是只有小于3％的患者能夠獲得完全緩解。大約50％的患者在伊馬替尼初始治療2年內發(fā)生繼發(fā)性耐藥，耐藥患者中位生存期僅為15個月。另一方面，野生型和

3、PDGFRAD842V突變的GIST對伊馬替尼治療不敏感。因此，單靠KIT抑制劑不能治愈GIST。深入探索GIST耐藥機制，尋找新的靶向治療方案迫在眉睫。
　　ETS家族是最大的信號依賴轉錄調控因子家族之一，其過度表達和許多人類腫瘤發(fā)生有關，近年來已成為各國學者關注的重點?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個ETS家族成員，它們均含有一個由85個氨基酸組成的特異DNA結合區(qū)（ETS區(qū)），該區(qū)與靶基因啟動區(qū)一個富含嘌呤的序列GGAA/T結合后調節(jié)基因轉

4、錄。通過調節(jié)細胞的增生、分化、凋亡及上皮-間質相互作用，ETS家族蛋白參與許多生理和病理過程。ETS變異體1(ETV1，ER81)是ETS家族成員之一，在染色體上定位為7p21.3。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中過度表達，參與腫瘤的形成和發(fā)展。Chi P等研究發(fā)現(xiàn)ETV1是GIST起源細胞存活的特異因子，在GIST細胞中存在異常表達，且ETV1在GIST中的表達水平明顯高于其他腫瘤，包括胃癌、肝癌、結直腸

5、癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。并且ETV1能夠與KIT協(xié)同作用，調控GIST細胞的增殖凋亡與惡性轉變。若能進一步證實ETV1調控GIST的致瘤轉化，那么靶向ETV1或ETV1相關信號治療將能夠解決GIST的imatinib耐藥問題，成為GIST分子靶向治療的一大突破。
　　目的：
　　檢測ETV1在胃腸道間質瘤組織和胃腸道間質瘤細胞系(GIST882)中的表達，分析GIST及對應瘤旁正常組織ETV1的表達差異，探究其與K

6、IT表達、臨床病理特征及危險程度分級的相互關系。通過體外合成siRNA干擾ETV1表達，觀察ETV1對GIST882細胞增殖能力的影響及其與細胞周期、凋亡的關系。探討ETV1影響胃腸道間質瘤發(fā)生發(fā)展的可能分子機制。
　　方法：
　　1、運用實時熒光定量PCR技術和Western Blot法檢測72對新鮮胃腸道間質瘤及其瘤旁正常組織、胃腸道間質瘤細胞系(GIST882)中ETV1基因和蛋白水平的表達。運用免疫組織化學的方法檢測

7、胃腸道間質瘤組織芯片（156例標本）ETV1的分布和表達強度。分析ETV1的表達與胃腸道間質瘤臨床病理特征的相互關系。
　　2、利用化學合成的siRNA瞬時轉染法轉轉染胃腸道間質瘤(GIST882)細胞，下調ETV1的表達，采用qRT-PCR法、Western blot法檢測ETV1表達變化。根據(jù)基因沉默效率進行篩選、并確定其中一條siRNA作為后續(xù)研究使用。通過細胞增殖檢測試劑盒CCK-8檢測ETV1下調對GIST882細胞增殖

8、能力的影響，通過流式細胞儀檢測ETV1下調對細胞周期和凋亡的影響。
　　3、通過Western Blot法檢測上述轉染細胞中Ras/Raf/MEK/ERK等相關信號分子的表達。
　　結果：
　　本實驗共收集72例胃腸道間質瘤手術切除新鮮標本。Western Blot和熒光定量PCR的結果顯示ETV1及KIT在GIST腫瘤組織中高度表達，而在正常瘤旁組織和其他類型的肉瘤組織中均無表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

9、胃腸道間質瘤細胞系（GIST882細胞）呈強ETV1表達。組織芯片（含156例標本）的結果與組織標本、細胞結果一致，表現(xiàn)為ETV1在間質瘤組織中呈廣泛散在的細胞核表達。研究發(fā)現(xiàn)，ETV1在胃GIST中的表達較為多見，與年齡、性別等無關(P＞0.05)。同時，ETV1的表達與KIT表達密切相關，差異有顯著性(P＜0.05)，從不同危險程度分級上看，ETV1在低中危GIST的表達略低于KIT，但是在高危組明顯高于KIT表達。
　　利用

10、瞬時轉染分別轉入3條ETV1 siRNA，qRT-PCR法檢測各組轉染24h、48h、72h后ETV1 mRNA水平變化。三條序列三個時間段的抑制率分別為:siRNA-A57.4％、63.0％、78.4％; siRNA-B37.5％、52.7％、65.5％; siRNA-C29.6％、46.1％、55.7％，較對照組mRNA表達顯著下調(P＜0.05)。抑制效率以siRNA-A序列轉染72h最佳。Westem blot進一步證實siRN

11、A-A能較好沉默ETV1蛋白表達，故選擇siRNA-A組進行后續(xù)試驗。CCK-8增殖實驗結果顯示:ETV1表達下調抑制GIST882細胞的增殖(P＜0.05)。細胞周期結果提示:ETV1表達下降后，G0-G1期比例上升，S期比例下降，與Control組和Negative組相比具有明顯差異。流式細胞儀檢測結果顯示ETV1表達下調促進GIST882細胞的凋亡，而Negtive組和Control組之間無顯著性差異。通過western blot

12、檢測轉染siRNA下調ETV1表達后Ras、p-c-Raf、 p-MEK、p-ERK的表達水平明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。但是總的c-Raf、 MEK、ERK沒有明顯的改變。
　　結論：
　　ETV1在胃腸道間質瘤組織、胃腸道間質瘤細胞系（GIST882細胞）中普遍高表達。siRNA沉默ETV1基因能夠顯著抑制GIST882細胞的增殖，阻滯細胞周期進程，促進細胞的凋亡。沉默ETV1基因后，Ras、p-c