小麥三個貯藏蛋白基因的克隆、原核表達及品質(zhì)效應(yīng)鑒定.pdf

1、小麥貯藏蛋白分兩種:麥谷蛋白(Glutenin)和醇溶蛋白(Gliadin)，麥谷蛋白也分兩種:高分子量谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基（low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS）。小麥貯藏蛋白是小麥面粉加工品質(zhì)的決定性因素，其含量超過小麥籽粒蛋白總量的80％。本研究以課題組自主選育的優(yōu)質(zhì)小麥新品種

2、“西農(nóng)538”和“西農(nóng)558”的基因組DNA為模板，根據(jù)GenBank中收錄的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin的基因序列，設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增、克隆測序等實驗技術(shù)，分別從這兩個小麥品種中得到了三種蛋白的基因編碼序列各一條，并進一步進行了序列比對及進化樹分析，同時以“西農(nóng)538”中獲得的三條基因序列為目標序列，誘導(dǎo)其在大腸桿菌表達系統(tǒng)中表達，然后通過蛋白純化和微量摻粉實驗研究比較這三個表達蛋白各自對小麥面粉的品質(zhì)效

3、應(yīng)。實驗結(jié)果如下:
　　1.利用設(shè)計的特異性引物，共得到了6條具有單一完整開放閱讀框的基因序列。其中從“西農(nóng)538”中克隆得到的HMW-GS、LMW-GS和α-gliadin基因序列的GenBank登錄號分別為KX452083、KX452081、KX452085，編碼區(qū)長度分別為1812bp、915bp和897bp;從“西農(nóng)558”中克隆得到的這三種蛋白的基因序列的登錄號分別為KX452084、KX452082、KX452086，

4、編碼區(qū)長度分別為1977bp、915bp和879bp。
　　2.通過氨基酸序列對比發(fā)現(xiàn):KX452083和KX452084主要由信號肽、N-端保守區(qū)、中間重復(fù)區(qū)和C-末端四個部分構(gòu)成，都有7個半胱氨酸(Cys)殘基，中間重復(fù)區(qū)有六肽和九肽重復(fù)單元，但沒有三肽重復(fù)單元，由此推測這兩個基因序列可能屬于y型亞基，同時經(jīng)過blastp比對和進化樹分析得知，兩條序列分別與1Dy10和1Dy12亞基有極高的相似度。KX452081和KX452

5、082主要由信號肽、N-端保守區(qū)、中間重復(fù)區(qū)(該區(qū)域是谷氨酰胺(Q)和脯氨酸(P)的富集區(qū)）、C-端保守區(qū)Ⅰ（含有5個Cys殘基）、C-端保守區(qū)Ⅱ(該區(qū)域含有豐富的谷氨酰胺(Q)和1個Cys殘基）和C-端保守區(qū)Ⅲ（含有1個Cys殘基）這六部分組成，通過序列比對、N/C端氨基酸組成(METRCIPG……VGTGVGAY)、Cys殘基的位置和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，得到的這兩條LMW-GS序列屬于Glu-D3位點、TypeⅤ(Group10)、m型

6、、C組LMW-GS。KX452085和KX452086主要由6部分組成:信號肽、N-端重復(fù)區(qū)、多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅰ、特征區(qū)Ⅰ、多聚谷氨酰胺區(qū)Ⅱ和特征區(qū)Ⅱ，其中KX452085含有6個Cys殘基，可形成3對分子內(nèi)二硫鍵;KX452086含有7個Cys殘基，不僅可以形成3對分子內(nèi)二硫鍵，多余的一個Cys殘基可能形成一個分子間二硫鍵。
　　3.依據(jù)本實驗的研究目的和前人的研究成果，以“西農(nóng)538”中克隆得到的三條序列（KX452083、KX

7、452081和KX452085）為研究對象，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，使它們在宿主菌Escherichia coli Trans B(DE3)中進行體外表達，通過SDS-PAGE凝膠電泳和Western blot檢測鑒定，結(jié)果表明這三個蛋白均成功表達。
　　4.對三個蛋白進行大量的體外表達，經(jīng)回收純化、低溫冷凍干燥和微量摻粉實驗（以中國春面粉為基礎(chǔ)面粉），得到了一系列相關(guān)參數(shù)。分析這些參數(shù)發(fā)現(xiàn)，KX452083(HMW-GS)與面粉筋力正相

8、關(guān)，但對面團彈性產(chǎn)生了負效應(yīng)，并且不利于面團的延伸;KX452081(LMW-GS)對面粉筋力的影響比較復(fù)雜，尚難確定相關(guān)性，但其對面粉彈性有增強作用，而對面團的延伸不利;KX452085(α-gliadin)對面粉筋力有負效應(yīng)，但使面團更易流變，且對面團的延伸和彈性有顯著的改善。此外，粉質(zhì)質(zhì)量指數(shù)（Farinograph quality number，F(xiàn)QN）是一種被用來評價面粉質(zhì)量的常用指標，以FQN為衡量標準分析比較這三個蛋白的品