羥基脲誘導的生精細胞凋亡及其作用機制研究.pdf

1、外源性化學(藥)物的生殖毒害作用逐漸引起人們的關注。近年來，隨著腫瘤患者生存期的延長，抗腫瘤藥物的遠期不良反應也日益受到重視。羥基脲(HU)是目前惟一用于臨床的核糖核苷酸還原酶抑制劑類抗腫瘤藥，主要用于治療黑色素瘤、髓性白血病及卵巢腫瘤等，近年來，其治療適應癥愈來愈廣泛，但到目前為止關于HU的雄性生殖毒性研究較少，而且主要集中于小鼠身上，未見系統(tǒng)的雄性生殖毒性研究資料。本研究在體外毒性試驗的基礎上，進行整體動物試驗以評價HU對大鼠生殖系

2、統(tǒng)的毒性作用特點及毒性作用機制；最后，在確定HU引起大鼠的生精細胞凋亡的基礎上，應用轉基因動物模型和分子毒理學技術深入探討了HU的睪丸毒性作用機制。 HU的體內外生殖毒性：雄性大鼠睪丸Sertoli-種質細胞共培養(yǎng)試驗表明，HU在0．001．0．1M濃度范圍內，對睪丸生精細胞具有明顯毒性，隨著給藥濃度和時問的增加，生殖細胞脫落率逐漸增加，細胞活性逐漸下降，LDH的漏出逐漸增加。孕13d大鼠胚胎中腦細胞微團培養(yǎng)顯示，HU可明顯抑制

3、中腦細胞的增殖和分化，阻止神經細胞分化和集落形成，呈現劑量一效應關系，對中腦細胞增殖、分化的半數抑制濃度(IVso和Dso)分別為0．018和0．078mM，兩者的比值為4．33，顯示HU可能具有強胚胎毒性。 整體動物毒性試驗表明，雄性Wistar大鼠分別連續(xù)10d給予100、200和400mg／kgHU后，從給藥D7天起，200rog／kg、400mg／kg組雄性大鼠體重明顯下降。停藥D9時，前列腺、精囊腺的重量和臟／體比有下

4、降趨勢，200mg／kg、400mg／kg組動物附睪不活動精子增加明顯。精子染色體結構分析顯示評估人群生育潛能閾值的COMPat隨劑量增加而增加，病理組織形態(tài)學觀察顯示曲細精管內生精細胞缺失、脫落明顯，400mg／kg組部分管腔甚至出現大量多核巨細胞，附睪出現膿腫。停藥D23時，各個劑量組睪丸臟／體比都明顯下降，400mg／kg組附睪臟／體比下降明顯，并且仍然有大量不活動精子，200mg／kg、400mg／kg組精子計數明顯減少；無論D

5、9和D23，各劑量組均有大量畸形精子。COMPat值的增加以及睪丸和附睪組織的病理損害，在停藥D23較D9更為嚴重，表明生育力受到嚴重傷害，而且在短期內不能修復。雄鼠末次給藥后D2雌雄大鼠交配，孕D15剖殺孕鼠，對妊娠結局的檢查顯示各組孕鼠體重，子宮和卵巢的臟器系數和各組雌鼠在交配率、平均黃體數、平均著床數和窩均活胎數和吸收率上沒有明顯差異，與400mg／kg組雄性大鼠交配的雌鼠受孕率明顯降低，活胎率降低，著床前丟失率明顯增加。

6、 綜合分析HU的一般生殖毒性研究的結果，HU生殖毒性作用的靶器官是睪丸和附睪，并對精子生成過程產生影響，停藥后一段時間內毒性表現具有延遲性，400mg／kg組HU可以影響雌鼠受孕，并對早期胚胎發(fā)育產生明顯影響，有一定的胚胎毒性，而對100mg／kg、200mg／kg組雌鼠妊娠結局的作用可能不明顯。HU會破壞培養(yǎng)的生殖細胞和支持細胞之間正常的相互作用，而導致細胞脫落，這種脫落可能是HU誘導精子生成障礙、降低精子計數的一個原因；上述整體動物

7、毒性試驗結果，與體外毒性試驗的預測、評估基本一致，說明體外毒性試驗結果，可以在一定程度上預測體內毒性試驗結果。但需要就HU對大鼠的一般生殖毒性機制作更為全面深入的研究和評價。 HU對大鼠的睪丸毒性及其作用機制：腹腔注射400mg／kgHU1或5d，分別在單次給藥后6、12和24h，以及連續(xù)給藥5d后D1或D10處死，取睪丸組織，光學顯微鏡下觀察，TUNEL、PAS染色顯示凋亡陽性小管的百分數和凋亡指數隨著HU劑量的增加而明顯增加

8、，12h時達蜂值，隨后減少；精原細胞和精母細胞特異性地受到影響；TUNEL陽性細胞呈現階段特異性，主要存在于生精周期的I．Ⅳ階段；RT-PCR和Western印跡分析凋亡相關基因、蛋白產物，顯示HU處理后，Bax水平沒有出現明顯變化，但Bcl-2表達水平在HU處理后6或12h明顯降低；相反，FasL和Fas的表達水平在單次給藥12h開始增加，并一直持續(xù)到連續(xù)給藥后的D16。上述結果表明，HU導致的大鼠睪丸生殖細胞的凋亡有細胞特異性和階段

9、特異性，這個過程涉及Bcl-2蛋白和Fas信號系統(tǒng)。 HU對轉基因小鼠的睪丸毒性及其作用機制：雄性FasL轉基因型(TG)及野生型(WT)DBA／C57BL小鼠的(2×2)析因設計對比研究表明：TG小鼠生精小管的本底細胞凋亡水平增高，Fas、FasLmRNA以及Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-9蛋白的本底表達水平也稍有增加。腹腔注射400／kgHU12h后，WT和TG小鼠睪丸生精小管形態(tài)無明顯變化，但曲細精

10、管細胞凋亡指數明顯增加，且TG小鼠較WT小鼠增加幅度更大。另外，雖然HU在TG及WT小鼠中均可誘發(fā)睪丸的DNA片段化和細胞凋亡相關基因Fas、FasLmRNA表達的上調；但與WT小鼠相比，TG小鼠的增加幅度更為明顯。Western印跡分析顯示，HU處理對WT和TG小鼠的凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表達無明顯影響，但可引起Fas、FasL、和Caspase-8等蛋白表達明顯上調，且TG小鼠的上調幅