Norrin基因在視網(wǎng)膜血管生成中的作用研究.pdf

1、Norrin基因是一種富含半胱氨酸的糖基化蛋白質(zhì)，屬于分泌型生長(zhǎng)因子，其C末端有半胱氨酸富集區(qū)域，提示其可能具有生長(zhǎng)因子作用，可能與內(nèi)皮細(xì)胞的移行和增殖有關(guān)?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，Norrin基因缺陷鼠視網(wǎng)膜表現(xiàn)為表層視網(wǎng)膜血管網(wǎng)發(fā)育遲緩和深層毛細(xì)血管網(wǎng)缺失。若將外源性Norrin轉(zhuǎn)入這種基因缺陷鼠的視網(wǎng)膜，可以恢復(fù)視網(wǎng)膜血管網(wǎng)的形成，改善視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，恢復(fù)視網(wǎng)膜部分功能。隨著對(duì)Norrin基因研究工作的開(kāi)展，Norrin與視網(wǎng)膜血管的關(guān)系引

2、起了越來(lái)越多人的關(guān)注。在此研究中，我們觀(guān)察了Norrin高表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞及正常新生小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育中的作用，并觀(guān)察了Norrin在視網(wǎng)膜新生血管發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)改變。包括： 第一部分人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定目的：體外培養(yǎng)并鑒定人類(lèi)視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)。方法：2％胰蛋白酶和0.066％Ⅱ型膠原酶消化視網(wǎng)膜，獲得視網(wǎng)膜微血管組織，用纖維連接蛋白包被培養(yǎng)皿促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁，用含1

3、0％胎牛血清的添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。抗第Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體及透射電鏡觀(guān)察鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。 結(jié)果：內(nèi)皮細(xì)胞第1d貼壁，第2d有細(xì)胞從組織塊中爬出，第5d形成克隆，2w左右細(xì)胞融合。傳至7～8代轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞。第Ⅷ因子相關(guān)抗原鑒定細(xì)胞免疫組化為強(qiáng)陽(yáng)性。 結(jié)論：利用10％胎牛血清的人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加物，并用纖

4、維連接蛋白包被培養(yǎng)瓶，能簡(jiǎn)單有效地培養(yǎng)出人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞。 第二部分Norrin基因?qū)RCECs作用的體外研究目的：探討AP-3myc-hNorrin/pRK5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HRCEC后對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期及凋亡的影響。 方法：以體外培養(yǎng)的HRCECs為模型，利用Lipofectimine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，設(shè)空白和陰性對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)Norrin，免疫組化和Western-Blot檢測(cè)myc在細(xì)胞的含量確

5、定轉(zhuǎn)染效率。采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)分析其細(xì)胞周期和凋亡,boyden小室法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。 結(jié)果：AP-3myc-hNorrin/pRK5質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖和遷移數(shù)分別較對(duì)照組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。細(xì)胞周期檢測(cè)示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組G2期細(xì)胞較對(duì)照組高(P=0.001)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)見(jiàn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組凋亡細(xì)胞比例較對(duì)照組低(P=0.005)。結(jié)論：Norrin高表達(dá)能促進(jìn)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HRCECs)增殖、

6、遷移及DNA合成，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，提示Norrin在視網(wǎng)膜血管生成中可能具有重要作用。 第三部分Norrin基因?qū)π律∈笠暰W(wǎng)膜血管發(fā)育的影響 目的：探討Norrin高表達(dá)對(duì)正常新生鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育的影響。 方法：新生3日齡(P3)C57BL/6小鼠，左眼為實(shí)驗(yàn)眼，玻璃體腔注入mNorrin-myc-AP/pRK5表達(dá)質(zhì)粒，右眼注入等量生理鹽水作為陰性對(duì)照。RT-PCR方法半定量檢測(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)Norrin表達(dá)變化

7、觀(guān)察轉(zhuǎn)染情況。視網(wǎng)膜鋪片及切片GSA(Lectin)染色觀(guān)察視網(wǎng)膜血管范圍和形態(tài)，伊文思藍(lán)視網(wǎng)膜鋪片觀(guān)察視網(wǎng)膜血管內(nèi)屏障功能情況。 結(jié)果：P6時(shí)，實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜中NorrinmRNA表達(dá)水平較對(duì)照眼表達(dá)高，表明mNorrin-myc-AP/pRK5表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入視網(wǎng)膜。P6時(shí)實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜表層血管網(wǎng)開(kāi)始進(jìn)入退化階段，P8時(shí)出現(xiàn)視網(wǎng)膜淺層血管向深層出芽，P10時(shí)深層血管已發(fā)育接近完全。而對(duì)照組P6時(shí)實(shí)驗(yàn)眼視網(wǎng)膜表層血管網(wǎng)豐富，P8

8、時(shí)視網(wǎng)膜淺層血管向深層出芽少，P10時(shí)深層血管尚未發(fā)育完全。與對(duì)照眼比較，小鼠視網(wǎng)膜血管發(fā)育過(guò)程提前。伊文思藍(lán)視網(wǎng)膜鋪片觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組視網(wǎng)膜血管無(wú)滲漏，具有良好的屏障功能。 結(jié)論：Norrin高表達(dá)能促進(jìn)視網(wǎng)膜血管特別是深層血管的發(fā)育和分化。Norrin可能在視網(wǎng)膜血管生成和管壁構(gòu)筑過(guò)程中起到重要作用。 第四部分氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型建立方法的改良目的：建立簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、成模率高的氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變小鼠模型。 方法

9、：用改良法(A組)和傳統(tǒng)方法(B組)分別建立氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變的C57BL/6小鼠模型，比較兩組的母鼠死亡率、乳鼠體重、成活率和成模率，視網(wǎng)膜冰凍切片GSL染色免疫組化觀(guān)察兩組的視網(wǎng)膜新生血管，熒光素灌注視網(wǎng)膜鋪片檢測(cè)視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)和新生血管的面積。 結(jié)果：改良法(A組)與傳統(tǒng)法(B組)相比較，乳鼠成活率未降低，且具有母鼠死亡率低，成模率高，動(dòng)物消耗量少的特點(diǎn)。改良法制作的小鼠模型視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)和新生血管面積較傳統(tǒng)法多而典型。

10、 結(jié)論：改良法操作簡(jiǎn)單，能構(gòu)建出高效、穩(wěn)定、典型的視網(wǎng)膜新生血管模型。該方法值得推廣和借鑒。 第五部分NorrinmRNA在氧誘導(dǎo)的血管增殖性視網(wǎng)膜病變中的動(dòng)態(tài)表達(dá) 目的：探討氧誘導(dǎo)的血管增殖性視網(wǎng)膜病變的小鼠視網(wǎng)膜中NorrinmRNA的表達(dá)變化及其意義。 方法：取P7、P12、P17的氧誘導(dǎo)血管增殖性視網(wǎng)膜病變小鼠，熒光素灌注視網(wǎng)膜鋪片觀(guān)察血管分布和形態(tài)。逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)P7、P8、P12

11、、P12.5、P13、P14、P15、P17、P19等時(shí)間點(diǎn)的小鼠視網(wǎng)膜中Norrin、VEGF、HIF-1αmRNA的表達(dá)。 結(jié)果：氧誘導(dǎo)血管增殖性視網(wǎng)膜病變小鼠在P17時(shí)視網(wǎng)膜有大量新生血管形成。缺氧12小時(shí)后，NorrinmRNA有顯著升高，缺氧24小時(shí)時(shí)到達(dá)高峰，然后緩慢下降。其變化趨勢(shì)與VEGF、HIF-1αmRNA的變化一致。 結(jié)論：NorrinmRNA在缺氧視網(wǎng)膜中明顯升高，并與VEGF和HIF-1α的變化