骨再生中羥基磷灰石材料的生物相容性研究.pdf

1、粉碎性骨折因常造成骨缺損治療比較困難，自體骨移植造成供區(qū)缺損。骨移植供體來源中的組織工程學(xué)人工骨組織具有來源廣泛，適用性強等優(yōu)點而成為研究熱點。組織工程研究中要素之一是種子細(xì)胞的篩選、鑒定和純化。成骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定已多見報道，但是在骨損傷再生愈合過程中，是否發(fā)生和存在更原始的骨祖細(xì)胞(未分化細(xì)胞)或成骨樣細(xì)胞?它們的成骨性能如何?分離成骨樣細(xì)胞的方法能否有所改進，這方面研究還少見文獻(xiàn)報道，有待進一步研究。我們建立了家兔骨缺損模型

2、，研究其骨損傷后骨再生愈合過程局部組織學(xué)形態(tài)變化，分離成骨樣細(xì)胞，為骨組織工程研究提供理想的種子細(xì)胞。 組織工程另一要素是生物材料支架，無機非金屬類的生物材料羥基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是骨組織中存在的天然無機物質(zhì)，骨鹽的主要成分，接近體內(nèi)成骨微環(huán)境，在組織工程化人工骨構(gòu)建中得到廣泛應(yīng)用。HA分子式是Ca10(PO4)6(OH)2。近年來，國內(nèi)外關(guān)于HA與成骨細(xì)胞結(jié)合構(gòu)建組織工程化人工骨的相關(guān)報道很多，但大部

3、分是大體的宏觀層次上的復(fù)合體性能的研究，對于HA對成骨細(xì)胞生長的毒副作用以及相關(guān)的檢測手段還少見報道。HA對成骨細(xì)胞的生物相容性和二者的相互作用機制的研究還很少，為此我們進行了成骨細(xì)胞和HA復(fù)合培養(yǎng)，研究HA對成骨細(xì)胞生長的影響，并初步探討其可能的分子生物學(xué)機制。 不加任何修飾的HA不利于細(xì)胞生長，施加一些因素來修飾HA，提高其生物相容性，其中Ⅰ型膠原是骨組織中天然有機成分，有利于細(xì)胞粘附、生長。本實驗研究PGE1(prosta

4、glandinE1，前列腺素E1)、Dex(dexamethasone，地塞米松)和HA及Ⅰ型膠原之間相互作用對成骨細(xì)胞的粘附、增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化和凋亡的相關(guān)基因表達(dá)的影響。為骨組織工程的生物支架材料的設(shè)計提供實驗參考。 目的： 為骨組織工程研究提供理想的種子細(xì)胞和骨缺損模型；為骨組織工程生物材料研究提供一種新的生物材料生物相容性檢測手段；探討HA、膠原、PGE1、Dex等因素對成骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方

5、法： 1、制作家兔雙側(cè)前肢橈粉碎性骨折骨缺損模型，在術(shù)后14d再次手術(shù)，觀察骨折斷端愈合狀態(tài)，分別做HE染色觀察斷端組織學(xué)形態(tài)變化，及分離、培養(yǎng)、鑒定成骨樣細(xì)胞。 2、HA片生物材料與小鼠MC3T3細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，利用PI-Hoechst33342熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況；利用逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(Reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR)的方法檢測骨橋蛋白(

6、osteopontin，OPN)和分化抑制因子(Inhibitorofdifferemiation/DNAbinding-2，Id2)的基因表達(dá)情況，初步分析細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機制。 3、MC3T3成骨細(xì)胞株在與HA片、鼠尾膠以及施加PGE1和Dex處理因素復(fù)合培養(yǎng)，檢測OPN、Id2、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase

7、，MAPK)和凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosisinducingfactor，AIF)基因的表達(dá)差異，來初步說明上述處理因素對成骨細(xì)胞的粘附、增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分化和凋亡的相關(guān)基因表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1、粉碎性骨折2周后，局部有骨痂形成，包含類骨組織和軟骨性骨痂。成功分離出原代成骨樣細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)鑒定為成骨樣細(xì)胞。 2、HA組的細(xì)胞凋亡平均百分率顯著高于正常組。Id2在正常對照組接種的早期(5d)有明

8、顯的表達(dá)，而晚期無表達(dá)；在HA組早期Id2無表達(dá)，在晚期(15d)有較弱的表達(dá)。OPN在正常對照組和HA組的前述兩個時刻均有明顯表達(dá)，無顯著差異。 3、Ⅰ型膠原使MC3T3細(xì)胞粘附良好，不易洗脫。細(xì)胞和HA融合緊密。PGE1使細(xì)胞變長；Dex使細(xì)胞增殖明顯，細(xì)胞形態(tài)變成矮柱狀。HA與鼠尾膠協(xié)同作用促進了OPN的表達(dá)；HA促進了ALP和MAPK的表達(dá)：HA抑制了Id2的表達(dá)，促進成骨細(xì)胞的分化。HA促進了AIF的表達(dá)，但是PGE1

9、可減低HA的促進AIF表達(dá)的作用。鼠尾膠協(xié)同HA促進了OPN、Id2、ALP和MAPK各基因的表達(dá)。PGE1抑制了OPN、ALP和MAPK表達(dá)，促進了Id2表達(dá)。Dex抑制了OPN和MAPK表達(dá)，促進了Id2表達(dá)，對ALP和AIF表達(dá)無顯著影響。 結(jié)論： 1、成功分離、培養(yǎng)出骨損傷后骨痂中的兔成骨樣細(xì)胞，為研究骨損傷后骨再生中原始細(xì)胞的作用提供了良好的模型。 2、不加修飾的HA片能夠促進MC3T3成骨細(xì)胞凋亡，需

10、要修飾改進。提供了一種原位檢測不透明生物材料生物相容性的簡便有效的方法。HA影響Id2的表達(dá)，在細(xì)胞生長早期通過抑制Id2的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，在培養(yǎng)晚期通過誘導(dǎo)Id2的表達(dá)促使細(xì)胞凋亡。 3、表明HA提供了成骨細(xì)胞成骨的細(xì)胞微環(huán)境，使細(xì)胞生長良好，表現(xiàn)出良好的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和成骨特性，同時也可促進成骨細(xì)胞凋亡，在骨重建中起一定作用。Ⅰ型膠原是良好的細(xì)胞外基質(zhì)，可以促進細(xì)胞粘附、生長和基因表達(dá)。10ng/mlPGE1抑制了OPN、ALP