貓杯狀病毒2280毒株反向遺傳系統(tǒng)的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、貓杯狀病毒(Feline Calicivirus，F(xiàn)CV)屬于杯狀病毒科水瘡性病毒屬，是感染家貓及野生貓科動(dòng)物的重要病原之一。FCV感染家貓能夠引起呼吸系統(tǒng)疾病、口腔潰瘍、結(jié)膜炎及慢性腸炎等，強(qiáng)毒感染引起全身系統(tǒng)性疾病(Virulent systemic disease，VSD)并導(dǎo)致較高死亡率。目前，對(duì)于該病的預(yù)防，仍以疫苗免疫為主，但現(xiàn)有疫苗僅能提供一定的臨床保護(hù)而不能完全阻止FCV感染，并且康復(fù)動(dòng)物長期持續(xù)的排毒，使得該病的防治更

2、加困難。
　　FCV2280是一株中等毒力的毒株，能引起泛嗜性感染，為了對(duì)FCV2280的致病機(jī)制有進(jìn)一步的了解，我們需要利用反向遺傳操作系統(tǒng)來研究病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。我們以pOK-12為載體構(gòu)建了FCV2280株的反向遺傳系統(tǒng)。首先，依據(jù)FCV2280基因組酶切位點(diǎn)特征，將基因組分為三段依次克隆于pOK-12載體中;同時(shí)在基因組5'末端和3'末端分別引入T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子和丁型肝炎核酶（HdvRz）序列;并將基因組

3、554位的XbaⅠ限制性酶切位點(diǎn)序列進(jìn)行同義突變作為重組病毒鑒定的遺傳標(biāo)記，獲得基因組全長cDNA表達(dá)質(zhì)粒pOK-2280。其次，將該表達(dá)質(zhì)粒線性化和體外轉(zhuǎn)錄加帽后，獲得基因組RNA;轉(zhuǎn)染CRFK細(xì)胞，獲得P1代重組病毒;提取病毒基因組RNA制各cDNA模板，對(duì)遺傳標(biāo)記進(jìn)行PCR擴(kuò)增和XbaⅠ酶切鑒定，結(jié)果表明拯救的病毒為重組FCV病毒。最后，生長曲線檢測結(jié)果顯示重組病毒與親本病毒生長動(dòng)力學(xué)無明顯差異。
　　為了鑒定FCV2280

4、毒株外源基因插入位點(diǎn)，首先，以pOK-2280為基礎(chǔ)，分別以p5.6基因的5'末端、p76基因3'末端、VP1基因5'末端及VP1基因第264～265核苷酸之間作為插入位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(eGFP)的表達(dá)質(zhì)粒。其次，表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染CRFK細(xì)胞后拯救重組病毒，所獲重組病毒分別感染CRFK細(xì)胞，進(jìn)行eGFP表達(dá)鑒定，結(jié)果表明，只有在VP1基因5'末端以及VP1基因第264～265核苷酸之間兩個(gè)位點(diǎn)的eGFP可以表