Tim-3調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化及其對肝癌細(xì)胞生長的影響.pdf

1、研究背景及目的:
　　 Tim-3(Tcellimmunoglobulindomainandmucindomain-containingmolecule-3)是2001年新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)分子，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。作為Th1細(xì)胞表面標(biāo)記分子，Tim-3與其配體galectin-9結(jié)合后負(fù)向調(diào)控Th1細(xì)胞功能，并誘導(dǎo)Th1細(xì)胞凋亡。新近研究發(fā)現(xiàn)Tim-3不僅特異性表達(dá)于極化終木期Th1細(xì)胞，而且在多種固有免疫細(xì)胞，包括NK細(xì)胞

2、、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上有較高水平表達(dá)。Tim-3與其配體相互作用，在不同固有免疫細(xì)胞介導(dǎo)不同的免疫調(diào)節(jié)作用，深入闡明Tim-3通路對固有免疫的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，對于闡明免疫相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　 作為重要的固有免疫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞是機(jī)體抗感染的第一道防線，參與多種免疫相關(guān)疾病。巨噬細(xì)胞具有很強(qiáng)的可塑性，在不同微環(huán)境中可以極化為兩種不同的亞群:經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化型巨噬細(xì)胞(M2)。

3、M1和M2型巨噬細(xì)胞在炎癥和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮不用作用。眾多研究表明，腫瘤微環(huán)境中存在大量巨噬細(xì)胞（腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，Tumor-associatedmacrophages，TAMs），近年研究證實(shí)TAMs主要為M2型巨噬細(xì)胞，能夠通過影響血管生成、免疫抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤生長。2007年Science報道，Tim-3組成性高表達(dá)于巨噬細(xì)胞，并通過NF-kB通路促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。然而Tim-3是否參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化，進(jìn)而

4、影響TAMs功能并參與腫瘤發(fā)生，迄今尚未見報道。本研究利用臨床標(biāo)本及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究Tim-3存M1/M2型巨噬細(xì)胞極化及TAMs功能和肝癌發(fā)生中的作用，為調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫提供新思路。
　　 方法:
　　 1Tim-3在M1/M2型巨噬細(xì)胞中的表達(dá)及其對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用
　　 1.1以腹腔居留巨噬細(xì)胞與小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)M1/M2巨噬細(xì)胞，并檢測Tim-3表達(dá)
　　 收集3-6只小鼠的腹腔居留巨噬細(xì)胞接種

5、于24孔培養(yǎng)板，每孔1×106個細(xì)胞，24h后分別加入終濃度100ng/mL及10ng/mL的LPS或IL-4刺激24h（PBS處理組為對照），誘導(dǎo)M1、M2型巨噬細(xì)胞。收集上述誘導(dǎo)模型的細(xì)胞和上清，凍存?zhèn)溆?。ELISA檢測IL-12及IL-10表達(dá);RT-PCR檢測M1、M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)分子，驗(yàn)證M1、M2細(xì)胞是否誘導(dǎo)成功，并流式檢測各組細(xì)胞Tim-3的表達(dá)。
　　 新鮮分離的骨髓細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1×106個細(xì)胞

6、。分別用20ng/mL的GM-CSF或100ng/mL的M-CSF誘導(dǎo)5d后，再以10ng/mL的LPS刺激24h，分別收集細(xì)胞及上清，同上驗(yàn)證M1、M2細(xì)胞表型，并流式檢測各組細(xì)胞Tim-3表達(dá)。
　　 1.2體外干擾實(shí)驗(yàn)研究Tim-3對M1/M2巨噬細(xì)胞極化的影響
　　 設(shè)計(jì)并合成針對鼠Tim-3的siRNAoligo及無關(guān)序列，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染淀粉誘導(dǎo)的腹腔巨噬細(xì)胞，RT-PCR、westernblot(WB)檢測Tim

7、-3表達(dá)，驗(yàn)證干擾效果。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染上述siRNA及無關(guān)序列至腹腔居留巨噬細(xì)胞或GM-CSF/M-CSF誘導(dǎo)60h的小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，48h后，分別加入LPS或IL-4繼續(xù)誘導(dǎo)M1/M2型巨噬細(xì)胞，24h后收上清，ELISA檢測M1/M2的標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-12及IL-10。
　　 2Tim-3調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化對肝癌細(xì)胞生長的影響
　　 2.1Tim-3在原發(fā)性肝癌患者外周血及肝癌浸潤C(jī)D14+細(xì)胞上的表達(dá)
　　

8、 收集24例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)患者及30例健康志愿者新鮮外周肝素抗凝血。收集4例原發(fā)性肝癌患者癌組織和對應(yīng)癌旁組織，剪碎，膠原酶消化3～6h后，200目不銹鋼網(wǎng)上輕輕研磨，收集單細(xì)胞懸液。用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離肝癌組織中浸潤淋巴細(xì)胞。上述細(xì)胞同時標(biāo)染CD14、Tim-3和相應(yīng)熒光同型對照抗體，流式檢測CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)。
　　 2.2共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究肝

9、癌細(xì)胞介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化及Tim-3表達(dá)調(diào)控
　　 將淀粉誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與小鼠肝癌細(xì)胞系H22以1∶4的比例接種于24孔板混合培養(yǎng)，分別在12h、24h、48h后洗去懸浮生長的H22，收集貼壁生長的巨噬細(xì)胞，流式檢測Tim-3的表達(dá)及M1、M2巨噬細(xì)胞表型。
　　 2.3阻斷Tim-3對肝癌細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的影響
　　 新鮮分離的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以5×104個/mL接種于24孔板（500mL/孔）。待

10、細(xì)胞貼壁后用終濃度為5μg/mL的Tim-3阻斷性抗體（IgG為對照）預(yù)處理1h后，加入2×105的H22細(xì)胞共培養(yǎng)，48h后收腹腔巨噬，流式檢測M1標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-12的表達(dá)。
　　 2.4動物實(shí)驗(yàn)研究Tim-3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化對肝癌細(xì)胞生長的影響
　　 6至8周齡的雄性BALB/c小鼠，后肢內(nèi)側(cè)皮下注射1×106小鼠肝癌細(xì)胞H22，建立小鼠肝癌模型。兩周后取瘤體，膠原酶消化，Percoll細(xì)胞分離液分離瘤體浸潤

11、淋巴細(xì)胞。同時，分離對應(yīng)小鼠脾細(xì)胞。上述細(xì)胞分別標(biāo)染CD11b、Tim-3和相應(yīng)熒光同型對照抗體，流式檢測CD11b+細(xì)胞Tim-3的表達(dá)。
　　 M-CSF誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞60h后轉(zhuǎn)染oligo干擾Tim-3，無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組為對照。繼續(xù)誘導(dǎo)48h后，與H22以1∶3比例混合，皮下注射BALB/c成瘤。定期測量瘤體大小，計(jì)算腫瘤生長曲線。注射12天后處死動物，稱瘤重。
　　 結(jié)果:
　　 1體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tim-

12、3高表達(dá)于M2型巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化
　　 1.1M2型巨噬細(xì)胞的Tim-3表達(dá)水平顯著高于M1型巨噬細(xì)胞
　　 為研究Tim-3在不同巨噬細(xì)胞亞群中的表達(dá)，分別利用腹腔居留巨噬細(xì)胞及骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)M1/M2型巨噬細(xì)胞。ELISA檢測結(jié)果顯示，LPS誘導(dǎo)的腹腔居留巨噬細(xì)胞及GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞均分泌高水平IL-12（235.01±4.86pg/mL，542.85±5.98pg/mL）及較低水平的IL-1

13、0(32.54±3.10pg/mL，87.64±6.26pg/mL);而IL-4刺激的腹腔巨噬細(xì)胞及M-CSF刺激的骨髓細(xì)胞分泌高水平IL-10(413.49±3.65pg/mL，759.63±5.38pg/mL)和較低水平的IL-12(36.74±3.05pg/mL，186.17±3.10pg/mL)，提示，M1/M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成功。RT-PCR檢測M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記分子，進(jìn)一步證明模型誘導(dǎo)成功。流式細(xì)胞術(shù)檢測不同巨噬細(xì)胞

14、Tim-3表達(dá)，結(jié)果顯示，M2型巨噬細(xì)胞的Tim-3表達(dá)水平顯著高于M1型巨噬細(xì)胞（腹腔巨噬細(xì)胞52.27％±7.02％vs35.53％±1.76％，p＜0.05;骨髓細(xì)胞60.10％±3.05％vs98.03％±1.56％,p＜0.01）。
　　 1.2抑制Tim3表達(dá)有效促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，抑制M2型巨噬細(xì)胞極化
　　 為進(jìn)一步研究Tim-3在巨噬細(xì)胞極化中的作用，設(shè)計(jì)針對Tim-3的siRNA，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)

15、胞，RT-PCR和WB結(jié)果表明siRNA能有效抑制Tim-3表達(dá)。收集腹腔居留巨噬細(xì)胞及骨髓細(xì)胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染針對Tim-3的siRNA后繼續(xù)誘導(dǎo)M1/M2型巨噬細(xì)胞。ELISA結(jié)果表明，與對照組相比，Tim-3siRNA轉(zhuǎn)染組LPS誘導(dǎo)的腹腔居留巨噬細(xì)胞及GM-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞分泌IL-12水平顯著升高（腹腔居留巨噬細(xì)胞:250.45±24.60pg/mLvs.587.41±20.63pg/mL，p＜0.01;骨髓細(xì)胞:423.81

16、±30.82pg/mLvs952.99±177.6pg/mL，p＜0.05）;與此相符，與對照組相比，Tim-3siRNA轉(zhuǎn)染組IL-4刺激的腹腔居留巨噬細(xì)胞及M-CSF誘導(dǎo)的骨髓細(xì)胞分泌IL-10水平顯著降低（腹腔居留巨噬細(xì)胞:350.37±11.77pg/mLvs136.91±5.66pg/mL，p＜0.01;骨髓細(xì)胞:792.43±68.51pg/mLvs318.74±56.51pg/mL，p＜0.05)。提示，抑制Tim-3表達(dá)

17、有效促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化，抑制M2型巨噬細(xì)胞極化。
　　 2Tim-3促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2型極化抑制肝癌生長
　　 文獻(xiàn)報道，多種腫瘤包括肝癌中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為M2型，并與預(yù)后不良相關(guān)，闡明肝癌微環(huán)境對巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)具有重要意義。我們第一部分的研究結(jié)果提示Tim-3參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2極化，在第二部分中我們重點(diǎn)研究Tim-3對肝癌TAMs極化中的作用及其在肝癌中的意義。
　　 2.1原發(fā)性肝癌患者

18、外周血及腫瘤內(nèi)CD14+細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高
　　 為研究Tim-3在肝癌TAMs中的作用，首先收集肝癌患者外周血及肝癌組織，流式細(xì)胞術(shù)檢測Tim-3表達(dá)。結(jié)果顯示，HCC患者外周血CD14+細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)顯著高于健康志愿者(P＜0.01);與癌旁組織巨噬細(xì)胞相比，肝癌組織內(nèi)TAMs中Tim-3的表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。提示，Tim-3參與肝癌TAMs的極化。
　　 2.2肝癌細(xì)胞體外共培養(yǎng)可促進(jìn)

19、M2型巨噬細(xì)胞極化并上調(diào)Tim-3的表達(dá)
　　 進(jìn)一步利用體外共培養(yǎng)體系研究Tim-3在肝癌TAMs極化中的作用，將淀粉誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞與H22以1∶4的比例共培養(yǎng)，不同時間點(diǎn)檢測Tim-3的表達(dá)，流式結(jié)果顯示，隨著與H22共培養(yǎng)時間的延長，腹腔巨噬細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)呈上升趨勢，RT-PCR結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞向M2型極化，進(jìn)一步提示Tim-3參與肝癌TAMs形成。
　　 2.3阻斷Tim-3可顯著減弱肝癌細(xì)胞介導(dǎo)

20、的M2型巨噬細(xì)胞極化
　　 為探討Tim-3對肝癌細(xì)胞介導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的影響，共培養(yǎng)體系中用特異性單克隆抗體阻斷Tim-3。流式結(jié)果顯示，阻斷Tim-3后，共培養(yǎng)中巨噬細(xì)胞分泌IL-12的能力增強(qiáng)（30.10％±1.84％vs49.80％±1.70％，p＜0.05）。提示，阻斷Tim-3可顯著減弱肝癌細(xì)胞對M2型巨噬細(xì)胞的極化作用。
　　 2.4荷瘤小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高，干擾Tim-3后的M2可明顯抑制

21、小鼠體內(nèi)腫瘤的生長
　　 為進(jìn)一步研究體內(nèi)Tim-3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化在腫瘤中的作用，首先利用H22皮下注射建立荷瘤鼠模型，兩周后最大瘤體直徑可達(dá)1cm。流式結(jié)果顯示小鼠瘤體浸潤C(jī)D14+細(xì)胞Tim-3表達(dá)水平顯著高于荷瘤小鼠脾CD14+細(xì)胞(P＜0.001)，與體外結(jié)果一致。進(jìn)一步將轉(zhuǎn)染Tim-3siRNA的M2巨噬細(xì)胞與H22混合后皮下注射建立荷瘤鼠模型，無關(guān)對照序列NC轉(zhuǎn)染組M2與H22的混合注射為對照。腫瘤生長曲線及瘤重

22、分析結(jié)果顯示，Tim-3干擾組瘤體的大小和重量顯著低于NC對照組，提示，抑制Tim-3后的M2可明顯抑制腫瘤的生長。
　　 結(jié)論:
　　 Tim-3高表達(dá)于腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞，并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化;原發(fā)性肝癌患者外周血及腫瘤內(nèi)CD14+細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著升高;Tim-3在肝癌細(xì)胞介導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化中發(fā)揮重要作用;抑制M2型巨噬細(xì)胞中Tim-3表達(dá)可明顯抑制小鼠體內(nèi)肝癌細(xì)胞的生長。