E2F1對神經元凋亡的調控.pdf

1、中山大學碩士學位論文E2F1對神經元凋亡的調控RegulationofNeuronalApoptosisbyE2F1專業(yè)名稱：申請人姓名：指導老師：答辯委員會主席：答辯委員成員：專；娩藥理學袁忠民黎明濤教授￡闌中山大學J’‘州2005年5月V7BB745E2F!對辯燧元鞘f麴髑捧但是，我們在研究細胞周期蛋白調控小腦顆粒神經元凋亡時，卻發(fā)現神經元在低鉀處理下轉錄因子E2FI并沒有被誘導表達，而是隨凋亡刺激時間延長被降解，進一步研究證實E2

2、F1具有促存活作用，其生物學功能和在胞內的生物學行為與現有的報道不符。實驗方法：1培養(yǎng)小腦顆粒神經元(CGNs)：取出生7—9天的SpragueDawley大鼠解剖后取小腦，經胰酶消化后按每毫升I5X106個細胞種植于專用培養(yǎng)板。體外培養(yǎng)7天分化成熟。(本論文中除專門標注，全部使用大鼠小腦顆粒神經元用于各個實驗)。2凋亡模型建立：分化成熟的CGNs，去掉條件培養(yǎng)基換成含25raMKCI的無血清基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)，這時cGNs繼續(xù)存活(通常將

3、這種處理稱為高鉀或者25K處理)。當培養(yǎng)基換成僅含5raMKCI的無血清基礎培養(yǎng)基時(通常將這種處理稱為低鉀或者5K處理)，CGNs逐漸發(fā)生凋亡，表現出明顯的凋亡特征，如胞體皺縮、核固縮、DNALadder、凋亡小體等。這是國際上公認的最經典的凋亡模型之一。3Hoeehst33258染色：Hoechst33258是一種DNA熒光染料，可以插入并結合于DNA鏈的A—T區(qū)，紫外光激發(fā)后，可釋放藍色熒光。正常神經元核內DNA分布相對均勻，核無

4、固縮，在視野中呈現體積較大的淺染核形態(tài)，而凋亡中的神經元其核內DNA濃聚，出現不同程度的固縮，故呈現體積明顯縮小的深染核形態(tài)。4腺病毒構建：使用Hindm，EeoRV雙酶切pRcFlagE2F1質粒(來自法國DidierMonte教授)獲得人的E2FI基因編碼區(qū)序列片段，T4連接酶定向插入pshuttle—CMV。PineI線性化后與Adeasy一1共轉化BJ5183細菌進行同源重組，得到AdFlag—E2F1腺病毒前體質粒。經PacI