根癌農桿菌介導須癬毛癬菌ZafA基因的遺傳轉化.pdf

1、須癬毛癬菌是一種重要的人畜共患皮膚癬菌，主要感染人與動物的皮膚角質層及其附屬角質化組織。鋅是微生物重要的必需微量金屬元素之一，是細胞中的第二大過渡金屬，對病原微生物的生長、繁殖、致病力具有重要作用。目前已在多種真菌中發(fā)現參與調控真菌細胞鋅離子穩(wěn)態(tài)的相關基因，其中鋅離子反應轉錄激活因子基因（ZafA）表達蛋白及其同源蛋白已被證明在病原性真菌胞內鋅穩(wěn)態(tài)調控和致病力中具有重要作用。通過轉錄組測序已在須癬毛癬菌中發(fā)現ZafA基因，但該基因及其表

2、達的蛋白功能目前仍不清楚。根癌農桿菌介導的遺傳轉化(ATMT)是目前真菌基因敲除的常用方法之一，已經成功應用于多種絲狀真菌的遺傳轉化。本文利用ATMT法對須癬毛癬菌ZafA基因進行遺傳轉化，構建ZafA基因轉化株，并對須癬毛癬菌ATMT轉化體系進行優(yōu)化，為后續(xù)ZafA功能驗證奠定基礎。試驗結果如下:
　　1、將構建完成的含有ZafA基因同源片段及潮霉素抗性標記基因的雙元載體pDHt/ZafA-ⅠⅡ∷hph轉入根癌農桿菌中，PCR驗

3、證轉化成功后，利用帶有雙元載體的根癌農桿菌介導轉化須癬毛癬菌分生孢子，PCR驗證結果證明須癬毛癬菌ZafA基因成功地被hph基因替代實現轉化。
　　2、在轉化過程中使用不同的固相載體（Hybond N+尼龍膜、PVDF膜、濾紙），不同共培養(yǎng)時間(36h、48 h、60h)，預培養(yǎng)中是否加入AS，在28℃共培養(yǎng)條件下對轉化體系進行優(yōu)化。發(fā)現預培養(yǎng)中加入AS獲得的轉化株數量顯著高于未加AS組，使用Hybond N+尼龍膜、濾紙均可獲得