馬鈴薯低溫糖化相關淀粉酶基因的功能鑒定及機制解析.pdf

1、馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是世界上最重要的非谷物糧食作物，在保證人類糧食安全方面具有重要作用。薯片和薯條加工產品在加工業(yè)中占據著主要地位，為保證原材料的持續(xù)供應，馬鈴薯塊莖經常貯藏于低溫條件下（不高于10℃），然而低溫貯藏會導致還原糖積累，即為低溫糖化現象，使其在油炸加工過程中產生褐化反應，影響產品品質。前人研究表明淀粉降解是低溫糖化的主要路徑之一，但是并未鑒定到對低溫糖化起特異作用的淀粉降解酶基因，淀粉降解途徑的

2、低溫糖化機理尚不清楚。因此，本研究從全基因組角度對馬鈴薯α-淀粉酶和β-淀粉酶家族成員進行了鑒定、功能驗證及作用機制解析，主要研究結果如下:
　　1.利用馬鈴薯基因組數據庫，鑒定到2個α-淀粉酶、7個β-淀粉酶家族成員，它們不對稱地分布在馬鈴薯染色體上。通過不同物種的α-淀粉酶和β-淀粉酶系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現淀粉酶進化比較保守，α-淀粉酶被聚為3個亞家族，β-淀粉酶被聚為4個亞家族。馬鈴薯β-淀粉酶基因家族成員基因結構分析表明，聚

3、在相同亞家族的成員有相似的基因結構，但葡糖基水解酶結構域的比對結果顯示，其中一個β-淀粉酶家族成員StBAM9可能不具活性。
　　2.利用具有不同低溫糖化抗性的馬鈴薯基因型，在不同植物組織及不同貯藏溫度下的塊莖中進行淀粉酶家族成員的表達分析，篩選到3個受低溫響應并且在塊莖中誘導表達的淀粉酶，分別是α-淀粉酶StAmy23、β-淀粉酶StBAM1和StBAM9。
　　3.為了明確StAmy23、StBAM1和StBAM9在細胞

4、中的作用部位，分別構建了這三個基因融合綠色熒光蛋白的表達載體StAmy23-GFP、StBAM1-GFP、StBAM9-GFP和淀粉粒標記基因融合紅色熒光蛋白的表達載體StGBSS-RFP，通過兩種方法（基因槍法和農桿菌介導的煙草瞬時表達方法），將目標基因與標記基因進行共表達，并與細胞質標記基因RFP和葉綠素自發(fā)熒光疊加分析，首次證明StAmy23定位于細胞質，StBAM1定位于質體基質，StBAM9定位于淀粉粒。此外，又對StBAM1

5、、StBAM9和StGBSS的葉綠體轉運肽和截去轉運肽的StBAM1、StBAM9和StGBSS進行了亞細胞定位，結果表明，它們的葉綠體轉運肽定位于淀粉粒，但是StBAM1葉綠體轉運肽不穩(wěn)定，可能后期轉移至基質，與其全長定位于質體基質相關。這些結果說明StBAM1和StBAM9的定位取決于自身的葉綠體轉運肽。
　　4.為了研究StAmy23、StBAM1和StBAM9在馬鈴薯塊莖低溫糖化中的功能，分別構建了StBAM1和StBAM

6、9基因的RNA干涉表達載體及StBAM1和StBAM9雙干涉表達載體，分別遺傳轉化不抗低溫糖化的馬鈴薯品種鄂馬鈴薯3號(E3)，RNAi-StAmy23轉基因株系由前人獲得。分別測定了轉基因株系的葉片淀粉含量及低溫貯藏塊莖中的糖含量、薯片油炸色澤、淀粉酶活性、淀粉含量等，結果表明，StBAM1和StBAM9參與了白天的葉片淀粉降解，但是在夜晚只有StBAM9與淀粉降解有關，而StAmy23在葉片淀粉降解過程中無顯著功能。在低溫貯藏的塊莖

7、中，與對照相比，干涉StBAM1的轉基因塊莖和同時干涉StBAM1和StBAM9的轉基因塊莖中β-淀粉酶活性降低，但是干涉StBAM9的轉基因塊莖中β-淀粉酶活性沒有顯著變化。干涉StBAM1和StBAM9均可抑制淀粉降解和還原糖積累，有效改善油炸加工品質，而雙干涉轉基因的效果則更明顯，說明StBAM1和StBAM9可能存在功能疊加。另外，可溶性淀粉含量在干涉StBAM1的轉基因塊莖中增加，但是在干涉StBAM9的轉基因塊莖中顯著降低，

8、表明StBAM1可能通過水解質體基質中的可溶性淀粉來調節(jié)低溫糖化，而StBAM9可能直接作用于淀粉粒來調節(jié)低溫糖化。此外，干涉StAmy23導致轉基因低溫貯藏塊莖中可溶性糖原含量顯著增加，還原糖含量降低，可能是StAmy23通過降解細胞質中的可溶性糖原來參與低溫糖化的調節(jié)。進一步分析不同轉基因塊莖中還原糖的含量表明，StBAM9在低溫糖化中的功能最顯著，這3個淀粉酶分別在不同的亞細胞位置水解不同的底物，在馬鈴薯低溫糖化過程中發(fā)揮著不同水

9、平的功能，首次揭示了淀粉水解路徑在低溫糖化中的貢獻。
　　5.利用酵母雙雜交系統(tǒng)分析了StAmy23、StBAM1、StBAM9分別與淀粉代謝相關蛋白磷酸酶(StLSF1和StLSF2)、葡聚糖水雙激酶(StGWD)和淀粉顆粒合酶(StGBSS)的互作關系，結果表明只有StLSF2與StBAM9互作，推測StLSF2可能參與到StBAM9介導的淀粉降解過程中。但原核表達蛋白StBAM1、StBAM9和StLSF2體外活性分析實驗證

10、明，StLSF2不影響StBAM1、StBAM9的活性，StBAM1、StBAM9也不影響StLSF2的去磷酸化作用，推測StLSF2可能不是參與StBAM9水解路徑的一個重要因子。
　　6.利用馬鈴薯抗低溫糖化材料10908-06、CW2-1和低溫糖化敏感材料E3的塊莖，經4℃貯藏5天后構建了酵母雜交文庫。以StBAM9和截去葉綠體轉運肽的StBAM9-P分別作為餌蛋白，進行酵母文庫篩選，總共篩選到63個潛在互作蛋白，其中一個潛