同型半胱氨酸對人血管內(nèi)皮細胞組織因子表達的影響及染料木黃酮的干預(yù)作用.pdf

1、第一部分同型半胱氨酸對內(nèi)皮細胞表達組織因子水平的影響 目的:研究同型半胱氨酸對原代培養(yǎng)的人大隱靜脈內(nèi)皮細胞組織因子(TF)表達水平的影響。 方法:采用酶消化法法原代培養(yǎng)人大隱靜脈內(nèi)皮細胞，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，通過Ⅷ因子免疫熒光法對培養(yǎng)細胞進行鑒定。選擇生長良好的第3-4代細胞用于實驗。分為：(1)空白對照組：1640培養(yǎng)基；(2)Hcy濃度組：不同濃度的同型半胱氨酸(10、20、50、80、100μmol/

2、L，)培養(yǎng)細胞24h；(2)Hcy時間組：50μmol/L的同型半胱氨酸，培養(yǎng)不同的時間(2、4、8、24、48、72h)。各培養(yǎng)瓶中的細胞，經(jīng)藥物干預(yù)后收集細胞及培養(yǎng)上清液，采用LDH試劑盒檢測各組培養(yǎng)上清液中LDH的活性，采用RT-PCR技術(shù)測定細胞中TF mRNA的表達，用ELISA方法檢測上清液中TF水平。 結(jié)果: 1.正常細胞生長良好，呈扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富，核圓形或橢圓形，居中，偶見雙核，隨細胞密度

3、增加呈現(xiàn)“鋪路石樣”排列；熒光顯微鏡下可見細胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達Ⅷ因子，符合內(nèi)皮細胞特征。 2.加入同型半胱氨酸后細胞粗糙，邊界不整齊；同型半胱氨酸各濃度組的LDH活性都顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義；同型半胱氨酸不同作用時間組，從4小時組開始，LDH活性逐漸增高，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。表明同型半胱氨酸同型半胱氨酸有直接的細胞毒作用。 3.給予不同濃度同型半胱氨酸(10、20、50、80

4、、100μmol/L)刺激24小時后，人大隱靜脈內(nèi)皮細胞TFmRNA及上清液中TF表達水平隨同型半胱氨酸濃度的增加而升高，即同型半胱氨酸干預(yù)與內(nèi)皮細胞TF表達有劑量-效應(yīng)關(guān)系，呈劑量依賴性。 4.給予同型半胱氨酸50μmol/L作用于人大隱靜脈內(nèi)皮細胞不同時間，TF的表達從4小時開始升高，隨刺激時間的延長，TF的表達持續(xù)升高，于72小時達到最高，即呈時間依賴性。 第二部分染料木黃酮對同型半胱氨酸誘導TF表達的干預(yù)作用

5、 目的:研究染料木黃酮對同型半胱氨酸同型半胱氨酸誘導內(nèi)皮細胞表達TF的干預(yù)作用。 方法:將細胞隨機分組：(1)空白對照組；(2)Hcy組：50μmol/L的同型半胱氨酸，培養(yǎng)細胞24h；(3)染料木黃酮組：染料木黃酮(5，10,20,40,50mg/L)，培養(yǎng)細胞24h；(4)染料木黃酮+Hcy組：染料木黃酮作用1h后再加入同型半胱氨酸(50μmol/L)，培養(yǎng)不同時間(2、4、8、12、24、48、72h)后收集細胞。MT

6、T法觀察染料木黃酮藥物對細胞增殖的影響，RT-PCR技術(shù)測定細胞中TFmRNA的表達，ELISA方法檢測細胞培養(yǎng)液中TF濃度。 結(jié)果： 1.不同濃度的染料木黃酮，分別作用6、12、24、48、72h，同對照組相比，細胞增殖能力無明顯變化。說明干預(yù)藥物本身對細胞沒有毒性作用。 2.用不同濃度的染料木黃酮預(yù)處理內(nèi)皮細胞1h后，再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育24小時，染料木黃酮對同型半胱氨酸所誘導的內(nèi)皮細胞培

7、養(yǎng)液中TF濃度的抑制，呈明顯的量效關(guān)系。共孵育12小時，染料木黃酮對同型半胱氨酸所誘導的內(nèi)皮細胞TFmRNA的抑制，呈明顯的量效關(guān)系。 3.40mg/L染料木黃酮預(yù)處理內(nèi)皮細胞1h后，再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育不同時間，染料木黃酮對同型半胱氨酸誘導TF蛋白表達水平的抑制具有明顯的時間依從性，8小時開始,48小時抑制作用達高峰。染料木黃酮對同型半胱氨酸誘導TFmRNA表達水平的抑制具有明顯的時間依從性，4小時開始,2