重組人促紅素的生產工藝研究.pdf

1、20世紀50年代初人們就認識到腎臟可以產生一種激素，刺激紅細胞生長，稱為促紅細胞生成素（簡稱EPO），主要由腎臟近曲小管附近的細胞合成和分泌，它的基本生理功能是刺激骨髓紅細胞的生成和釋放，由于紅細胞沒有細胞核、線粒體、核糖體等細胞成分，不能通過自身分裂增殖，因此“自身生成促紅素”是人體產生紅細胞的唯一途徑。而人體中EPO是作為促使造血干細胞生成的重要部分，其含量的多少直接影響紅細胞生成的數量。
　　 1985年科學家應用人工重組

2、方法合成了EPO，稱為重組人促紅素(rhEPO)。至今已廣泛應用于各型腎臟病貧血患者的治療并取得十分滿意的結果。自1997年國內開始自主生產重組人促紅素以來，質量得到了不斷提高，與進口產品的差距也越來越小，但隨著產品市場價格的不斷降低，消費者對質量要求的不斷提高，需要對生產工藝進行進一步摸索、優(yōu)化，在保證產品質量的前提下，降低生產成本。
　　 目的：
　　 本研究以重組人促紅素為研究對象，分析重組人促紅素的質量情況，并采

3、取有效手段對重組人促紅素的質量情況進行監(jiān)控。同時對生產工藝進行優(yōu)化，達到提高質量、降低成本的目的。
　　 方法：
　　 1.重組人促紅素質量情況的檢測通過對樣品的關鍵質量指標進行生物學活性（體內比活性）、免疫學活性（體外比活性）、唾液酸含量測定和等電聚焦分析，找出幾項檢測指標的關系，進而為快速檢測產品質量提供參考。有利于在產品工藝改進中檢測產品的質量情況。
　　 2.細胞擴增期血清的篩選實驗通過在rhEPO生產種

4、子細胞擴增階段進行培養(yǎng)基中不同類型血清的選擇實驗，擺脫生產血清依賴進口的胎牛血清的現狀。
　　 3.細胞擴增期添加因子及其比例的篩選通過在rhEPO生產種子細胞擴增階段添加不同氨基酸，觀察細胞生長狀態(tài)，篩選適合細胞生長的氨基酸。
　　 利用篩選的類胎牛血清添加不同濃度合適的氨基酸類型，進行細胞擴增階段不同氨基酸及其濃度的選擇。
　　 4.維持期無血清培養(yǎng)基的篩選在維持階段細胞培養(yǎng)中添加血清會給后續(xù)純化過程帶來諸多

5、不便，隨著細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展，無血清培養(yǎng)基逐漸成為細胞培養(yǎng)中的主流。本實驗通過篩選不同廠家無血清培養(yǎng)基，并對細胞產物進行檢測，確定最適合本單位細胞生長的無血清培養(yǎng)基。
　　 5.連續(xù)培養(yǎng)期收獲最佳溫度的篩選細胞培養(yǎng)的維持階段是細胞分泌代謝產物的關鍵階段，通過摸索細胞收獲階段的最佳條件，嚴格控制培養(yǎng)溫度，保證產品收率。
　　 6.不同階段中間體穩(wěn)定性的考察對生產工藝不同步驟獲得的中間體：收液、反相前中間體、DEAE收液分別

6、放置不同時間后，進行相應后續(xù)的純化過程，得到原液后測定其唾液酸含量、生物學活性，考察存放時間對糖基化的影響。
　　 結果：
　　 1.重組人促紅素質量的檢測方法研究通過相關性的分析，唾液酸與體內比活性顯著相關，而與體外比活性不相關.同樣體內比活性與體外比活性在唾液酸含量低時也不相關，而在唾液酸含量高時也有一定的相關性。同時唾液酸含量和IEF有一定相關性，IEF圖譜中酸性帶多的唾液酸含量高。因此可以用唾液酸含量及等電聚焦的

7、測定代替耗時長、誤差大的體內比活性測定，從而快速反映制品的質量水平。
　　 2.細胞擴增期血清的篩選實驗本部分通過對細胞培養(yǎng)擴增時期的血清進行了篩選，選擇出了與進口胎牛血清相似的國產類胎牛血清。作為進一步實驗的基礎。
　　 3.細胞擴增期添加因子及其比例的篩選結合上一部分實驗的成果，通過篩選在培養(yǎng)基中加入氨基酸類型及加入濃度，篩選出的氨基酸為絲氨酸，用量為0.05g/10L，配上選擇的類胎牛血清能在細胞擴增期達到與進口胎

8、牛血清類似的效果。為降低血清成本監(jiān)定基礎。
　　 4.維持期無血清培養(yǎng)基的篩選通過對細胞維持培養(yǎng)期進行無血清培養(yǎng)基的篩選。選擇出EXCELL-302是較適合本公司細胞生長的。
　　 5.連續(xù)培養(yǎng)期收獲最佳溫度的篩選通過對細胞維持期培養(yǎng)溫度的選擇，發(fā)現37℃條件下更有利于CHO細胞的生長與產物的分泌。
　　 6.中間體存放穩(wěn)定性的考察通過對不同中間體存放時間的考察，培養(yǎng)收液的中間體在放置2周后，反相層析前中間體在放

9、置1周后；DEAE前中間體在放置2天后再進行純化所得原液的質量將受到很大影響。
　　 結論：
　　 在rhEPO的檢驗中，由于體內活性與唾液酸和含量有一定的相關性，而唾液酸含量也能在等電聚焦圖譜中得到體現，因此可以用唾液酸含量、等電聚焦來快速反應制品某些方面的質量。
　　 在細胞擴增階段可以用國產類胎牛血清結合一定濃度的氨基酸來代替進口胎牛血清進行細胞培養(yǎng)；且在細胞維持培養(yǎng)期培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度對產品質量和收率有重要