基于活性的化學(xué)小分子探針的設(shè)計與合成及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、新藥研發(fā)是一個漫長而又耗時的過程,通常包括如下幾個階段:靶點的鑒別、先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、小分子化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化、臨床前藥效學(xué)和毒性評價及臨床試驗等。其中靶點鑒別是藥物發(fā)現(xiàn)過程的開始,也是最為關(guān)鍵的階段之一。利用化學(xué)小分子的多樣性,選擇適當?shù)幕钚孕》肿?設(shè)計合成能夠高選擇性地作用于靶點蛋白,同時探測蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)以及與活性小分子作用模式的探針——化學(xué)小分子探針,可以為重大疾病的診斷和防治提供新的標記物、新的藥物作用靶點和新的先導(dǎo)結(jié)構(gòu),從

2、而為創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 近年發(fā)展起來的基于活性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,結(jié)合點擊化學(xué)技術(shù),是運用設(shè)計合成末端帶有炔基或疊氮基且同時還具有活性的小分子探針共價標記靶蛋白后,將改造后末端帶有炔基或疊氮基報告基團(Reporter or Tag),如熒光素或生物素,通過點擊化學(xué)連接到探針分子上,這樣就可以成功標記、檢測或用來純化其作用的靶點蛋白。
　　 格爾德霉素是目前開發(fā)較為成功的HSP90抑制劑,具有很強的抗原蟲和抗腫

3、瘤活性。格爾德霉素通過競爭性結(jié)合HSP90的N-末端ATP/ADP結(jié)構(gòu)域,特異性地抑制HSP90所必需的ATP酶活性,從而抑制了的分子伴侶功能,對腫瘤細胞的生長、生存、凋亡產(chǎn)生重要影響。
　　 本課題在已知的格爾德霉素抗腫瘤作用構(gòu)效關(guān)系基礎(chǔ)上,在其分子結(jié)構(gòu)的17位引入末端炔基或疊氮基團,設(shè)計合成源自格爾德霉素,具有活性的探針(如可以選擇性、特異性與HSP90相結(jié)合)。與經(jīng)修飾、改造后帶末端炔基的報告基團羅丹明B在點擊化學(xué)條件下,

4、與已經(jīng)和靶點蛋白共價結(jié)合的探針分子相鏈接,以標記腫瘤細胞內(nèi)的靶點蛋白。
　　 本論文的具體內(nèi)容包括:
　　 1、格爾德霉素的發(fā)酵制備與分析鑒定在格爾德霉素的發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)了6種形態(tài)菌落(GF1,GF2,GF3,MF1,MF2,MF3),分別對其做了發(fā)酵條件摸索。發(fā)現(xiàn)使用固體平板培養(yǎng)基培養(yǎng)時,用燕麥瓊脂比較適合菌株緩慢生長,有利于后來的液體發(fā)酵培養(yǎng)。防止初級代謝過于旺盛,次級代謝反而受到了抑制,菌體容易老化失去活性。液體發(fā)

5、酵培養(yǎng)超過6天,培養(yǎng)物變得十分粘稠,使得提取分離變得困難。因此用GF1作為種子接種在液體培養(yǎng)基,培養(yǎng)6天后,立刻進行提取分離為最佳發(fā)酵選擇。后經(jīng)提取純化,最終得到產(chǎn)率較高,純度大于95％的格爾德霉素。
　　 2、格爾德霉素化學(xué)小分子探針及報告基團RB1的設(shè)計與合成共設(shè)計合成了格爾德霉素化學(xué)小分子探針3個,通過與GA-FITC競爭結(jié)合HSP90α實驗,發(fā)現(xiàn)G2與HSP90α具有較強的親和作用(EC50=13nM)。設(shè)計合成了報告基

6、團RB1。靶點蛋白標記實驗表明,其非常適合用點擊化學(xué)。
　　 3、G2-RB1-HSP90α用作高通量篩選(HTS)模型的建立利用G2-RB1-HSP900α建立了適合用作高通量篩選的模型:從結(jié)果可知,DMSO(v/v)含量不超過4％為佳。最后優(yōu)化的條件為G2(2nM)與Hsp90α(30nM)親和反應(yīng)3小時,加入RB1(5nM)和CuI(1 nM),DMSO(v/v)含量不超過4％為佳。通過該條件對已知的Hsp90抑制劑格爾德

7、霉素、TPR2A、ATP、ADP進行了EC50測定。結(jié)果分別為104±3.1 nM,31±3.9nM,43.0±2.2,190±11.0。
　　 4、探針的抗腫瘤作用及與細胞靶點蛋白標記實驗研究采用MTT法對G2的抗腫瘤活性進行評價;通過對比發(fā)現(xiàn),設(shè)計合成的格爾德霉素G2化學(xué)小分子探針與格爾德霉素具有相似的抗腫瘤細胞增殖抑制作用;在細胞蛋白標記實驗中,均采用FTC-133腫瘤細胞株;第一組給以不同劑量的格爾德霉素化學(xué)小分子探針,