尼古丁刺激樹突狀細(xì)胞抗HBV的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是一個(gè)全球性的公共健康問題，其慢性感染引起的病毒性肝炎是嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病。目前對(duì)HBV的慢性感染尚缺乏非常有效的治療手段。臨床上具有持續(xù)性療效的方法是利用IFN-α進(jìn)行系統(tǒng)治療，可在40％患者體內(nèi)取得抑制HBV復(fù)制的效果，但僅有5%～10%接受治療的患者HBsAg轉(zhuǎn)陰。此外，利用核酸類似物如拉米夫定(lamivudine)進(jìn)行治療可以快速降低血清HBV DNA

2、水平并使得癥狀好轉(zhuǎn)，但短期治療會(huì)導(dǎo)致肝病迅速復(fù)發(fā)，長期治療易形成抗性病毒變異株。近來對(duì)HBV感染的過繼性免疫治療研究日益增多，過繼免疫治療普遍采用體外抗原負(fù)載樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell，DC)后回輸體內(nèi)的方法，如將HBsAg負(fù)載的DC回輸至HBV耐受者體內(nèi)，可誘導(dǎo)出HBV特異性的免疫反應(yīng)，抑制病毒復(fù)制，但這種方法誘導(dǎo)DC抗病毒的效率有待提高。因此，發(fā)現(xiàn)新的抗HBV的治療方案非常必要。
　　 DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原

3、提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell，APC)，作為適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者，在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可造成DC功能的異常，包括共刺激分子表達(dá)的下調(diào)和抗原提呈能力的下降等。尼古丁是煙草中的一種主要成分，近年來已被作為藥物廣泛應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、結(jié)腸癌和唐氏綜合癥的治療。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁刺激可上調(diào)DC表面共刺激分子的表達(dá)，增強(qiáng)其抗原提呈能力。將尼古丁刺激的DC回輸至小鼠體內(nèi)可

4、達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。由于機(jī)體抗腫瘤和抗病毒都需要抗原特異性的殺傷性T細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)，因此我們推測(cè)尼古丁刺激的DC對(duì)機(jī)體抗HBV的免疫反應(yīng)具有相似的效果。本研究是將尼古丁刺激DC用于抗病毒的嘗試和探索。
　　 本研究中，我們首先以Western Blot和流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry,FCM)的方法檢測(cè)尼古丁刺激后DC表面CD80和甘露糖受體(Mannose Rece

5、ptor, MR)的表達(dá)，結(jié)果表明：尼古丁刺激后DC表面共刺激分子CD80的表達(dá)明顯提高，MR的平均熒光密度(Mean Fluorescent Intensity, MFI)從63.68增加到76.35。然后，我們以尼古丁刺激DC，聯(lián)合HBV抗原或抗原肽負(fù)載后，與同種異型T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR)，分別以BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme Linked I

6、mmunosorbent Assay, ELISA)檢測(cè)HBV特異性T細(xì)胞的增殖和IL-12的分泌。我們發(fā)現(xiàn)，尼古丁刺激可增強(qiáng)DC介導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞增殖的能力，并促進(jìn)MLR中IL-12的分泌。表明尼古丁刺激可增強(qiáng)DC的抗原提呈功能并促使DC誘導(dǎo)Th0向Th1方向極化。我們又進(jìn)一步將尼古丁處理聯(lián)合HBV抗原負(fù)載的DC回輸至小鼠體內(nèi)，以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunospot, ELISPOT)檢測(cè)HBV特異性

7、CTL的增殖，乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)釋放法檢測(cè)CTL的功能。結(jié)果顯示，尼古丁刺激可增強(qiáng)DC誘生HBV特異性CTL的能力，并對(duì)靶細(xì)胞具有特異性殺傷功能?？紤]到臨床應(yīng)用的可能性，我們比較了尼古丁與IFN-γ、IL-15和IL-18在增強(qiáng)DC功能上的優(yōu)劣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在介導(dǎo)HBV特異性T細(xì)胞增殖方面，尼古丁刺激DC的效果優(yōu)于IFN-γ，與IL-15和IL-18相似；在促進(jìn)IL-12分泌方面，尼古丁刺激D

8、C的效果優(yōu)于IFN-γ和IL-15，與IL-18相似。最后，我們通過阻斷相關(guān)的信號(hào)通路初步探討了尼古丁刺激增強(qiáng)DC功能的可能機(jī)制，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)的結(jié)果均表明，尼古丁對(duì)DC的刺激作用與PI3K/Akt和MAPK通路相關(guān)。
　　 通過以上研究，我們證明了尼古丁刺激DC可增強(qiáng)機(jī)體抗HBV的免疫反應(yīng)，尤其是可更有效的誘導(dǎo)出具特異性殺傷作用的CTL，且尼古丁刺激DC的作用優(yōu)于或類似于IFN-γ、IL-15和IL-18，為進(jìn)一