NF-κBp50-p65和IκBα在慢性氟中毒大鼠骨腎損傷機(jī)制中的作用及意義.pdf

1、目的：觀察慢性氟中毒大鼠骨、腎組織中細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Factor Kappa B，NF-κB）信號(hào)途徑相關(guān)基因蛋白及mRNA水平表達(dá)的變化，深入探討慢性氟中毒骨骼及腎臟病變的分子機(jī)制。
　　方法：用不同濃度的含氟水飼養(yǎng)大鼠8個(gè)月，觀察氟斑牙發(fā)生情況及測(cè)定尿氟含量，明確氟中毒模型建立成功后處死大鼠，測(cè)其骨氟含量；光鏡觀察骨及腎組織形態(tài)學(xué)改變；酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbnen

2、t Assay，ELISA）檢測(cè)大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphataseform5b，TRACP5b）含量；抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）鑒定破骨細(xì)胞（Osteoclast，OC）并計(jì)數(shù)；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（Transferase-mediated dUTP-bintin，TUNEL）定位并計(jì)數(shù)腎組織中凋亡細(xì)胞個(gè)數(shù)；流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)腎組織中細(xì)胞凋亡率。免疫組織化學(xué)（Immu

3、nohistochemistry，IHC）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，Real-time PCR）分別檢測(cè)骨和腎組織中NF-κB p50、NF-κB p65、IκBα(Inhibitor of kappa B,IκBα)和Bcl-2(B-cell Lymphoma-2，Bcl-2)、Bax(Bcl-2 accociated X protein，Bax)的蛋白及mR

4、NA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：1、實(shí)驗(yàn)組大鼠出現(xiàn)不同程度氟斑牙損害，尿氟及骨氟含量隨染氟濃度的增加而逐漸增加。
　　2、光鏡觀察到骨組織呈骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。ELISA結(jié)果顯示氟中毒大鼠血清TRACP5b含量在低氟組增加顯著（P<0.05），高氟組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與低氟組比較降低（P<0.05）。IHC發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，p50、IκBα在低氟組表達(dá)升高（P<0.05），在高氟組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；p65則均無(wú)統(tǒng)

5、計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Real-timePCR結(jié)果示p50、p65、IκBα mRNA表達(dá)也呈低氟增加、高氟降低的趨勢(shì)，與蛋白表達(dá)水平一致。
　　3、HE結(jié)果顯示氟中毒大鼠腎臟病變主要分布于皮髓質(zhì)交界處及髓質(zhì)，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的腫脹等改變；高氟組甚至可見(jiàn)間質(zhì)明顯充血。IHC發(fā)現(xiàn)p50、p65和IκBα在腎小管上皮細(xì)胞胞漿和胞核呈陽(yáng)性著色，隨染氟劑量的增加，p50和p65陽(yáng)性著色強(qiáng)度逐漸減弱，IκBα陽(yáng)性著色強(qiáng)度逐漸增

6、強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Real-timePCR顯示，隨染氟劑量的增加，p50和p65 mRNA表達(dá)較對(duì)照組逐漸降低，IκBα mRNA表達(dá)較對(duì)照組逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與蛋白表達(dá)水平一致。
　　4、破骨細(xì)胞Bcl-2及Bax陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均表現(xiàn)為在低氟組增加、高氟組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Real-timePCR結(jié)果示Bcl-2及Bax mRNA表達(dá)與蛋白表達(dá)水平一致。p50、p

7、65及 IκBα與 Bcl-2/Bax比值呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.587、r=0.676，P<0.05）；p65與Bax/Bcl-2比值之間無(wú)相關(guān)性。
　　5、TUNEL及流式細(xì)胞學(xué)顯示腎小管上皮凋亡細(xì)胞隨染氟劑量的增加而逐漸增加（P<0.05）。Bcl-2和Bax在腎小管上皮細(xì)胞胞漿呈陽(yáng)性著色，隨染氟劑量的增加，Bcl-2陽(yáng)性著色強(qiáng)度逐漸減弱，Bax陽(yáng)性著色強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Real-timePCR