CaM在弓形蟲入侵過程中的機制研究.pdf

1、頂復(fù)門寄生蟲是一類嚴格的胞內(nèi)寄生生物，對人和動物會造成嚴重的疾病。頂復(fù)門寄生蟲的模式生物之一——剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)，全球大約有超過三分之一的人口被其所感染，免疫能力低下的個體和新生兒甚至會受到生命的威脅。弓形蟲擁有如此廣泛的宿主范圍與它強大的入侵機制有密切的關(guān)系。鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使，調(diào)控著弓形蟲多個生命活動，尤其是蟲體入侵和逸出過程。而鈣離子信號通路發(fā)揮作用需要依賴于各類鈣離子相關(guān)蛋白，但是目前

2、對于這些鈣相關(guān)蛋白知之甚少，它們之間的關(guān)系也尚不清楚，鑒定它們在鈣離子信號通路中的作用，以及它們的互作關(guān)系可以進一步解釋弓形蟲的入侵機制，為藥物靶標的篩選提供依據(jù)。
　　本研究以鈣調(diào)蛋白(簡稱CaM)為研究對象，利用CRISPR/Cas9和Cre-LoxP系統(tǒng)對CaM在RH△HX蟲株中進行敲除，比較CaM基因敲除蟲株和RH△HX蟲株在復(fù)制能力和入侵能力上的差異;同時，利用BioID技術(shù)，篩選CaM的互作蛋白，試圖發(fā)現(xiàn)更多的鈣離子信

3、號通路中的功能蛋白。具體實驗內(nèi)容如下:
　　(1) CaM蛋白原核表達和多克隆抗體的制備。構(gòu)建pGEX-KG-CaM原核表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒在表達感受態(tài)BL21(DE3)中能夠順利表達，將表達的蛋白純化后進行動物免疫，收集免疫后的動物血清，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測抗體效價，結(jié)果顯示該多克隆抗體具有較高水平的抗體效價。
　　(2) RH△HX-LoxP-CaM蟲株的構(gòu)建。利用Cre-LoxP系統(tǒng)對CaM基因的條件性敲除。首先，構(gòu)建能夠

4、識別CaM基因座的pSAG1∷Cas9-U6∷sgCaM的CRISPR質(zhì)粒和同源替換的模板質(zhì)粒pUC19-CaM-YFP，然后將擴增出來的同源替換片段和pSAG1∷Cas9-U6∷sgCaM質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)到RH△HX蟲株的速殖子中，用黃嘌呤和霉酚酸進行藥物篩選，再通過限制性稀釋的方法進行單克隆的篩選，經(jīng)擴大培養(yǎng)后用PCR和IFA進行鑒定，結(jié)果顯示成功獲得RH△HX-LoxP-CaM蟲株。
　　(3) CaM敲除株表型研究。在RH△H

5、X-LoxP-CaM蟲株的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染能夠表達Cre剪切酶的質(zhì)粒pmin-eGFP-Cre對CaM基因進行剪切，從而實現(xiàn)CaM的缺失。將CaM的缺失株與RH△HX蟲株同時進行胞內(nèi)復(fù)制實驗和入侵實驗，發(fā)現(xiàn)缺失株和RH△HX蟲株在胞內(nèi)的復(fù)制能力沒有多大的差異;但是缺失株的入侵能力有明顯缺陷，入侵能力較RH△HX蟲株顯著性下降。
　　(4) BioID技術(shù)篩選與CaM的互作蛋白。用生物素標記經(jīng)過遺傳改造后的蟲株RH△HX-BirA*-C

6、aM和原始蟲株RH△HX，經(jīng)過24h的作用后，通過間接熒光免疫和Western-blot檢測到RH△HX-BirA*-CaM蟲株有被生物素標記上的特異蛋白，為了進一步確定這些蛋白，進行了質(zhì)譜分析。經(jīng)過質(zhì)譜結(jié)果的分析對比，從本實驗得到25個特異性的蛋白質(zhì)。對鑒定到的這些蛋白質(zhì)進行功能和定位的分析，推測內(nèi)膜復(fù)合物(IMC)和果糖1，6-二磷酸醛縮酶與CaM存在互作的可能性，但它們之間具體的關(guān)系還需要進一步實驗驗證。
　　本研究主要利用