犢牛輪狀病毒的分離鑒定及快速診斷方法的建立.pdf

1、牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原，犢牛感染輪狀病毒后，由于胃腸道的功能紊亂而導(dǎo)致生長變緩，而持續(xù)性腹瀉容易導(dǎo)致機體脫水，甚至休克死亡。自1982年在中國分離到水牛輪狀病毒以來，相繼在中國分離到豬、兔、雞的輪狀病毒。引起犢牛腹瀉的輪狀病毒主要為A群輪狀病毒，根據(jù)其中和抗原VP7的差異可將輪狀病毒分為不同的血清型(G1～G14)。美國學(xué)者ANITLVPARWANT等1993年采用核酸探針檢測犢牛輪狀病毒，試驗結(jié)果證實G6血清型占檢測樣本總

2、量的36.8％(37/102)，G8血清型為2.9％,12.7％為G10血清型。目前，國內(nèi)對牛輪狀病毒的研究還僅僅停留在病原的分離上，對輪狀病毒在細(xì)胞內(nèi)的病理變化和輪狀病毒的快速診斷方法尚屬空白。 本研究從山東暴發(fā)犢牛腹瀉的地區(qū)采集腹瀉犢牛的糞便，接種MA-104細(xì)胞后，連續(xù)傳代后分離到一株輪狀病毒，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行了初步的研究。該毒株為山東分離到的首株犢牛輪狀病毒，分離到的牛輪狀病毒傳至第4代出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，該輪狀病毒

3、能在MA-104細(xì)胞上穩(wěn)定繁殖，傳代。 將該輪狀病毒分離株在MA-104細(xì)胞上傳至27代，病毒培養(yǎng)28-36h后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變。電鏡下病毒粒子具有光滑的囊膜和車輪狀結(jié)構(gòu)，具有典型的輪狀病毒的結(jié)構(gòu)特征。對輪狀病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖情況進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)輪狀病毒在細(xì)胞內(nèi)可以大量增殖，同時細(xì)胞出現(xiàn)線粒體腫脹，細(xì)胞膜溶解破裂等微觀的病理變化，但試驗中發(fā)現(xiàn)輪狀病毒在接種細(xì)胞時，可以成功在感染的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行高倍數(shù)增殖的病毒量并不多，可能與輪狀病毒特

4、殊的培養(yǎng)條件有關(guān)。 輪狀病毒的VP7基因組由1062個核苷酸組成，編碼323個氨基酸，在不同血清型之間具有嚴(yán)格的保守性，根據(jù)在NCBI上已發(fā)表的NCDV標(biāo)準(zhǔn)株和IND參考株VP7基因序列，用DNAStar軟件Meglign對其進(jìn)行分析后，使用RT-PCR方法擴增VP7基因和G6、G8、G10的特異性基因，并針對各血清型的相對保守區(qū)設(shè)計的引物，擴增A群輪狀病毒各血清型的特異性片段。本次試驗首次使用A群輪狀病毒不同血清型的特異性引物

5、，擴增各血清型的特異性片段，對分離到的輪狀病毒進(jìn)行血清型的鑒定。在研究中分離到的輪狀病毒使用分子生物學(xué)方法進(jìn)行血清型的鑒定，其中用G8、G10特異性引物沒有擴增出目的片段，通過人輪狀病毒與牛輪狀病毒的G6血清型的編碼VP7中和抗原的基因序列相比較發(fā)現(xiàn)，CHLY株與NCDV株具有98.7％的核苷酸同源性，氨基酸的同源性為97.5％。將CHLY株的VP7全基因序列進(jìn)行Blast比較分析發(fā)現(xiàn)，該序列與輪狀病毒G6血清型的核苷酸同源性最高，為8

6、2.4％-99.06％，其中與人G6型輪狀病毒的同源性在82％-84％之間，具有比較高的核苷酸同源性。 本試驗建立了輪狀病毒半巢式RT-PCR快速檢測的方法，并對濟南周邊地區(qū)腹瀉犢牛進(jìn)行了輪狀病毒的檢測。本研究建立的一步法半巢式RT-PCR使用一對引物可以迅速檢測豬和牛輪狀病毒感染，并且能夠同時鑒定牛輪狀病毒主要的血清型。通過對輪狀病毒G6血清型NCDV株和豬輪狀病毒的PCR結(jié)果表明試驗使用的引物對能擴增輪狀病毒VP7全基因并可

7、鑒定輪狀病毒的G6血清型。通過對PCR方法與傳統(tǒng)的病毒分離方法比較，結(jié)果表明PCR檢測輪狀病毒的敏感度方面，PCR比病毒分離的方法高，細(xì)胞分離病毒的方法雖然準(zhǔn)確性高，但分離率較低。通過對23份臨床腹瀉樣品的檢測，結(jié)果表明，輪狀病毒在荷斯坦牛群中廣泛存在，其中G6血清型是主要的輪狀病毒血清型。 本研究首次對山東省牛輪狀病毒進(jìn)行了病原分離和血清型鑒定，并建立了半巢式-RT-PCR，對濟南周邊地區(qū)的奶牛腹瀉樣品進(jìn)行了檢測。研究發(fā)現(xiàn)，牛