VEGF誘導(dǎo)成神經(jīng)分化的間充質(zhì)干細(xì)胞定向遷移研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)損傷后的功能恢復(fù)非常困難，主要原因是腦內(nèi)神經(jīng)元的再生能力差。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derivedmesenchymal stem cells，BM-MSCs/MSCs)可在自體獲得且能在體外穩(wěn)定擴(kuò)增，并可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，有望用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，故骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化相關(guān)的基礎(chǔ)研究是十分重要的。移植MSCs治療CNS損傷包括兩個(gè)重要的

2、因素：MSCs定向遷移至損傷部位；MSCs的成神經(jīng)分化。
　　 體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)可以誘導(dǎo)MSCs的遷移；在病理狀態(tài)下，損傷區(qū)域會(huì)釋放大量VEGF，誘導(dǎo)MSCs向損傷區(qū)域的遷移。VEGF和細(xì)胞膜上的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascularendothelial growth factor receptor，VEGFR)結(jié)合，激活細(xì)胞外信號(hào)

3、調(diào)節(jié)激酶(extracelluar signal regulated kinases-1/2，ERK1/2)、應(yīng)激活化蛋白激酶/c-jun氨基末端激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun NH2-terminal kinase，SAPK/JNK)、p38MAPK和磷脂酰肌醇3激酶/Akt(phosphatidylinositol3-kinase/Akt，PI3K/Akt)信號(hào)通路，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞的增

4、殖、分化和遷移。
　　 本實(shí)驗(yàn)室的的前期研究結(jié)果顯示，不同分化狀態(tài)的MSCs向C6膠質(zhì)瘤條件培養(yǎng)基和SDF-1alpha遷移的細(xì)胞數(shù)不同，因此我們猜測(cè)MSCs的分化狀態(tài)影響它們的趨化性遷移，為了進(jìn)一步驗(yàn)證MSCs的成神經(jīng)分化狀態(tài)和其遷移行為之間的關(guān)系，我們利用Dunn chamber和Boyden chamber檢測(cè)了成神經(jīng)分化不同階段的MSCs向VEGF的定向遷移行為，同時(shí)Western blot檢測(cè)了和MSCs遷移密切相關(guān)的

5、PI3K/Akt和MAPKs通路對(duì)VEGF的應(yīng)答。
　　 我們采用Percoll分離法在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增大鼠骨髓來源MSCs，應(yīng)用抗氧化劑誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，運(yùn)用Dunn chamber從個(gè)體水平研究分化細(xì)胞在VEGF濃度梯度下的遷移速率、遷移效率和遷移軌跡。接著，我們運(yùn)用Boyden chamber從群體水平研究MSCs在成神經(jīng)分化過程中的趨化性遷移(Chemotaxis)和隨機(jī)運(yùn)動(dòng)(Chemokinesis)

6、。Boyden chamber結(jié)果顯示，下室加入不同濃度VEGF后，不同狀態(tài)細(xì)胞向同一濃度VEGF遷移的數(shù)量不同，不同濃度VEGF誘導(dǎo)同一狀態(tài)細(xì)胞的遷移數(shù)量也不同，同時(shí)，利用活細(xì)胞工作站結(jié)合Dunnchamber對(duì)細(xì)胞進(jìn)行微速攝影視頻分析(time-lapse video analysis)顯示在某一分化階段(預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí))的MSCs具有更高的遷移效率。接著，我們通過Western blot檢測(cè)了在。VEGF刺激下這些通路關(guān)鍵分子的磷

7、酸化水平的改變，結(jié)果顯示各條通路達(dá)到磷酸化最大值的時(shí)間不同，同一時(shí)間各條通路磷酸化的程度不同，而且這些現(xiàn)象隨著細(xì)胞狀態(tài)的改變而改變。最后，采用PI3K/Akt和MAPKs抑制劑阻斷信號(hào)通路后，利用Dunn chamber和Boyden chamber觀察抑制劑對(duì)細(xì)胞定向遷移的影響，結(jié)果顯示抑制劑對(duì)遷移的影響和分化的狀態(tài)密切相關(guān)，推測(cè)這些通路在成神經(jīng)分化的MSCs定向遷移中是選擇性起作用的。
　　 以上結(jié)果證明，MSCs的分化影響

8、了其向VEGF的定向遷移，也就是說，不同分化狀態(tài)的MSCs顯示出不同的遷移行為。MSCs分化狀態(tài)影響其對(duì)誘導(dǎo)因子的趨化性遷移是一個(gè)普遍的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)室關(guān)于干細(xì)胞生長(zhǎng)生長(zhǎng)因子(hepatocyte growthfactor，HGF)，干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)，血小板衍生因子(platelet derivedgrowth factor，PDGF)的研究同樣證明了這種現(xiàn)象的存在，雖然進(jìn)一步的分子機(jī)制仍待于探索，但是