Hog1類Bbhog1的基因敲除對球孢白僵菌毒力和抗逆性的影響.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的殺蟲微生物，在害蟲生物防治中具有廣闊的應用前景。但目前有關昆蟲病原真菌侵染致病的分子機理研究尚缺乏明晰的認識，限制了真菌殺蟲劑的開發(fā)利用。MAPK是一類廣泛存在于真核生物的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。MAPK級聯(lián)反應逐級磷酸化將胞外信號放大并傳遞。微生物能夠通過該級聯(lián)反應對外界信號的誘導作出相應的反應。近年來的研究表明，MAPK胞外信號傳導途徑與植物和人類病原真菌的發(fā)育、分化及致病性密切相關，成為研

2、究病原真菌發(fā)育分化及侵染致病分子機理的重要對象。但MAPK信號途徑在昆蟲病原真菌的毒力和抗逆性有何影響?目前尚無報道。 本實驗室從昆蟲病原真菌球孢白僵菌(Beauveriabassiana)中克隆了與酵母HOG1類MAPK同源的基因Bbhog1。為了弄清該基因的功能，本文利用同源重組的方法敲除球孢白僵菌Bbhog1基因，并分析了Bbhog1的缺失對菌株的抗逆能力和毒力的影響，為研究昆蟲病原真菌發(fā)育分化與侵染致病中MAPK信號傳導

3、途徑奠定了基礎。 主要結果如下：1.利用同源重組方法獲得了4個敲除Bbhog1基因的球孢白僵菌缺失突變體，分別命名為△Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484。Southern雜交驗證表明：外源片段以單拷貝整合到基因組中，4個突變體均無隨機插入突變；球孢白僵菌基因組中的Bbhog1基因(2.3kb)被含有破壞的該基因序列和標記基因的約6kb片段成功置換。 2.表型分析表明：

4、 ①在0.4MNaCl滲透條件下，敲除Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)和菌絲生長受到明顯抑制；在0.8MNaCl滲透條件下，完全抑制其菌絲生長。而野生型菌株和空載(pk2-bar：：GFP)轉化子在上述條件下，雖然生長速度受到一定影響，但仍可以萌發(fā)和生長。說明敲除Bbhog1的缺失突變體對高滲透壓敏感性增加。 ②在亞高溫條件(32℃)下，敲除Bbhog1基因的缺失突變體孢子幾乎不萌發(fā)。但是將生長正常的菌絲打孔接種到新鮮

5、的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株和pk2-bar：：GFP空載轉化子沒有明顯差別。由此可見，亞高溫逆境條件下，Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)明顯受到抑制。 ③紫外照射處理表明，敲除Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)率顯著降低，突變體△Bbhog1255，△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484菌株在24hr孢子萌發(fā)率分別比野生菌株降低了27.42﹪、63.86﹪、36.45﹪和27.11﹪。而

6、空載(pk2-bar：：GFP)轉化子經紫外照射后的萌發(fā)率與野生菌株沒有明顯差異?？梢夿bhog1基因與球孢白僵菌對紫外輻射抗性的調節(jié)也相關。 上述結果表明，Bbhog1基因與球孢白僵菌對滲透壓、溫度和紫外輻射等環(huán)境脅迫因子的抗性密切相關。 3.生物測定的結果發(fā)現(xiàn)，Bbhog1基因與球孢白僵菌的毒力密切相關。在107個/mL分生孢子濃度下，突變體△Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbho

7、g1484菌株對桃蚜的半致死時間(LT50)明顯延長，達236hr、228hr、185hr和283hr，分別是野生菌株的LT50137hr的1.7、1.7、1.3和2.1倍。而空載(pk2-bar：：GFP)轉化子與野生菌株相比，半致死時間沒有明顯差異。Bbhog1基因敲除使菌株對桃蚜的毒力顯著降低。 上述結果表明，敲除Bbhog1基因導致球孢白僵菌的毒力下降，對高滲、亞高溫和紫外線的抗性降低；推測Bbhog1基因與球孢白僵菌毒