柑橘珠心胚起始相關miRNA挖掘與csi-miR156a調(diào)控體細胞胚發(fā)生作用機理.pdf

1、柑橘是世界上廣泛栽培且具有較高經(jīng)濟價值的重要果樹。其常規(guī)雜交育種因受到珠心胚等因素干擾導致進程緩慢、效率不高;同時，珠心胚因含有母本全部遺傳信息而具有固定優(yōu)良性狀的潛能。因此，珠心胚發(fā)生的分子機理研究將為柑橘育種提供重要理論依據(jù)。microRNA（miRNA）是植物生長發(fā)育過程中的一類重要調(diào)控因子。本研究通過比較柑橘單胚與多胚品種胚珠miRNA表達水平差異，鑒定可能與珠心胚發(fā)生相關的miRNA，為深入探討miRNA介導調(diào)控珠心胚起始的內(nèi)

2、在機制奠定基礎。另一方面，生物技術也是柑橘育種的重要途徑，體細胞胚發(fā)生是獲得離體再生植株的常見方式，是柑橘離體種質(zhì)保存與生物技術育種的重要環(huán)節(jié);柑橘多數(shù)品種的愈傷組織體胚發(fā)生能力隨繼代時間延長而逐漸減弱甚至喪失，一定程度上限制了柑橘生物技術與遺傳改良研究的開展。基于前入研究基礎，本研究以高度保守的miR156為候選關鍵miRNA，對其在柑橘體細胞胚發(fā)生過程中的潛在功能及相關調(diào)控機制展開深入分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.小RNA

3、高通量測序挖掘柑橘珠心胚起始相關miRNA
　　以一對橘與一對柚/葡萄柚單胚/多胚品種為材料，選擇珠心胚起始細胞出現(xiàn)前后兩個時期，取胚珠進行小RNA深度測序。在橘胚珠中鑒定了91條已知的和60條新的miRNAs，預測的靶基因分別為695和163個;柚/葡萄柚中共鑒定了93條已知的及66條新的miRNAs，分別對應417和152個預測的靶基因。在一對橘品種的胚珠中兩個時期均得到13個差異表達miRNAs，而柚/葡萄柚分別獲得31和4

4、1個，僅有2個差異表達miRNAs(保守的miR1446a和新的miRN23-5p)在這兩對材料的胚珠中都表現(xiàn)差異表達。實時定量PCR驗證了其中6個差異表達的miRNAs，大部分與測序結(jié)果一致。基于前人的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對其進行重新優(yōu)化分析，獲得305個共有的差異表達基因。Gene ontology(GO)分析表明逆境響應過程在上調(diào)基因中顯著富集，進一步發(fā)現(xiàn)在該生物過程中大部分基因與氧化逆境響應相關，這些基因在兩個多胚品種的胚珠顯著高于

5、單胚品種胚珠。因此，推測氧化逆境響應過程可能是影響柑橘珠心胚起始的重要因素。qRT-PCR分析表明，miRN23-5p在2個多胚品種6個胚珠發(fā)育時期的表達量均低于單胚品種，而其預測的2個靶基因表達模式恰好相反。煙草瞬時表達系統(tǒng)進一步表明，miRN23-5p能夠剪切其中一個靶基因Cs9g06920，暗示miRN23-5p與Cs9g06920的互作可能參與珠心胚起始過程。
　　2.csi-miR156a在體細胞胚發(fā)生過程中的功能驗證及

6、調(diào)控作用研究
　　利用RACE技術獲得csi-miR156a基因編碼區(qū)CsMIR156A全長，擴增結(jié)果表明該序列在8個柑橘品種間無明顯差異。將攜帶前體MIR156a的超量表達載體轉(zhuǎn)入弱胚性的山金柑愈傷組織，并成功獲得轉(zhuǎn)基因愈傷組織系。體胚發(fā)生能力分析表明，轉(zhuǎn)基因愈傷系的體胚發(fā)生能力明顯高于野生型。qRT-PCR分析表明，2個靶SPL（CsSPL3和CsSPL14）在miR156超表達愈傷組織系中的表達相比野生型下調(diào)，且這2個靶SP

7、L基因的表達模式與柑橘不同品種的體胚發(fā)生能力負相關，推測這兩個SPL可能負調(diào)控體胚發(fā)生能力。亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)這兩個SPL均定位于細胞核。轉(zhuǎn)錄激活實驗結(jié)果表明CsSPL14有自激活現(xiàn)象，能夠激活下游報告基因的表達;而CsSPL3沒有自激活。構建CsSPL3和CsSPL14的RNAi載體，轉(zhuǎn)化弱胚性的山金柑愈傷組織;經(jīng)體胚誘導及體胚發(fā)生能力統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，與csi-miR156a超量表達愈傷組織系表型相似，山金柑CsSPL3和CsSPL14RN

8、Ai愈傷組織系的體胚發(fā)生能力均顯著提高。
　　利用數(shù)字表達譜分析比較超量表達miR156的山金柑愈傷組織系與野生型，發(fā)現(xiàn)參與逆境響應及激素介導的信號轉(zhuǎn)導途徑等生物過程在上調(diào)基因顯著富集，而下調(diào)基因主要參與甲基化及細胞周期等相關過程。qRT-PCR檢測8個參與逆境響應過程差異表達基因的表達情況，表明這些基因在miR156超量表達與2個SPL基因干涉系均表現(xiàn)相似的表達模式。利用酵母雙雜交篩庫及點對點驗證獲得2個與CsSPL14潛在的互

9、作蛋白，分別為CsARK1和SnRK催化亞基KIN10(CsAKIN10)。隨后利用雙分子熒光互補技術再次驗證了以上互作關系。亞細胞定位分析表明CsAKIN10定位在細胞核。
　　綜上所述，本研究鑒定了柑橘兩對單胚/多胚品種胚珠中已知與新的miRNA，并發(fā)掘了可能與珠心胚起始相關的“miRNA-靶基因”調(diào)控組合;驗證了csi-miR156a及其靶基因SPLs在體細胞胚發(fā)生過程中的功能，篩選了其中一個SPL的互作蛋白，并對SPL與其