相關基因多態(tài)性與腎移植患者他克莫司個體化用藥的研究.pdf

1、據(jù)最新統(tǒng)計，目前國內大約有100萬名終末期腎病患者，并以每年50-100/100萬的發(fā)生率在增長，而腎移植是治療腎衰竭的最有效的方法，但發(fā)生排斥反應是導致腎移植失敗的主要原因，因此免疫抑制劑能否合理應用成為左右腎移植預后的關鍵。
　　 他克莫司(tacrolimus，F(xiàn)K506)是目前防治腎移植術后免疫排斥反應的一線免疫抑制劑，然而治療窗窄、藥動學個體差異大一直是困擾該藥臨床用藥的難題。目前臨床上雖然進行常規(guī)的治療藥物監(jiān)測(th

2、erapeutic drug monitoring，TDM)，根據(jù)血藥濃度來調整用藥劑量，但其最大的弱點是滯后性，部分患者在監(jiān)測前就出現(xiàn)血藥濃度過低或過高導致的不良反應，這對于移植術后初期的患者尤為危險。因此找出他克莫司藥動學個體差異大的產(chǎn)生原因，實現(xiàn)他克莫司的個體化應用，才是解決該問題的關鍵。
　　 同時，他克莫司價格昂貴，終身服用給患者造成了沉重的經(jīng)濟負擔，因此也制約了它的使用，地爾硫卓常作為其節(jié)約劑在臨床上配伍使用，而我們

3、在臨床觀察中也發(fā)現(xiàn)合用中藥護肝藥五酯片(每片含五味子酯甲7.5 mg)能顯著提高他克莫司濃度，有望成為新一代的節(jié)約劑。因此，如能從遺傳藥理學與合并用藥兩個方面考慮他克莫司的個體化用藥，以制定他克莫司的劑量預測方程，將有可能實現(xiàn)他克莫司安全、有效、經(jīng)濟的個體化用藥。目前國內外仍未有類似的報道。
　　 多年的研究表明20％～95％的藥物反應和處置的個體差異是由遺傳因素引起的。目前國內外有關他克莫司的個體化用藥研究主要集中在藥物代謝酶

4、(CYP3A4、3A5)及轉運蛋白(P-gp，由MDR1基因編碼)的遺傳多態(tài)性上，然而目前結論比較一致的只有CYP3A5*3與他克莫司濃度密切相關。雖然CYP3A4*1B也被證明與他克莫司藥動學相關，但是中國人群中并未發(fā)現(xiàn)該突變，因此該突變不可能是造成中國人他克莫司藥動學差異大的主要原因。而MDR1基因多態(tài)性的影響則仍無定論。CYP3A4*1G是新近發(fā)現(xiàn)的在中國人群CYP3A4基因中發(fā)生頻率最高的單核苷酸多態(tài)性(single nucle

5、otide polymorphism，SNP)，國內有研究發(fā)現(xiàn)其與CYP3A4酶活性升高相關，因此該位點也可能與他克莫司藥動學相關。
　　 此外，近年來，核受體作為關鍵的轉錄調控因子在藥物代謝酶及轉運蛋白的表達調控中所起的重要作用逐漸被認識。其中，孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR，由NR1I2基因編碼)被發(fā)現(xiàn)能同時調控CYP3A4/3A5、MDR1的表達。因此NR1I2的基因多態(tài)性也可能通過影響CYP3

6、A4/3A5、MDR1的表達從而間接影響他克莫司的藥動學。
　　 目前國內外有關CYP3A4、CYP3A5、MDR1的基因多態(tài)性的特點和發(fā)生頻率的研究較為系統(tǒng)，在不同種族都有較為詳盡的報道。但對于NR1I2基因多態(tài)性目前只有針對非裔美國人和高加索人的研究資料，無完善的亞洲人/中國人的相關研究，而且從目前的研究結果可知NR1I2的突變種族差異極大。
　　 綜上，本課題將首先對中國健康人群NR1I2基因的SNP進行篩查，并對

7、位于關鍵區(qū)域的SNP進行功能研究，隨后將根據(jù)文獻與本課題前期研究結果確定在腎移植患者中各個基因待研究的位點，通過回顧性研究綜合分析CYP3A4、CYP3A5、MDR1、NR1I2的基因多態(tài)性及合并用藥(地爾硫卓、五酯片)與他克莫司濃度的關系，篩選出有統(tǒng)計學意義的影響因素，建立劑量預測方程，并通過臨床應用進行驗證，希望能在首次給藥前制訂出最適合該患者的給藥方案，使血藥濃度盡早達到治療窗，從而降低患者由于多次劑量調整導致濃度波動而產(chǎn)生的風險

8、，實現(xiàn)他克莫司的個體化應用。
　　 第一部分PXR/NR1I2基因多態(tài)性研究
　　 目的：
　　 研究中國健康漢族人PXR/NR1I2的基因多態(tài)性，并對位于關鍵調控區(qū)域的SNP進行功能研究。
　　 方法：
　　 采用PCR-直接測序法，對NR1I2基因的5'UTR、3'UTR、各外顯子及近端內含子的已知與未知的SNP進行篩查i采用報告基因的方法檢測兩個位于啟動子關鍵調控區(qū)域的SNP的功能。

9、　　 結論：
　　 中國健康漢族人群的NR1I2基因中共發(fā)現(xiàn)16個SNP，其中位于NR1I2基因啟動子關鍵調控區(qū)域的A-24622T與C-24446A能使自身轉錄表達增強。中國健康漢族人群NR1I2的SNP的種類及發(fā)生頻率與高加索人及非裔美國人存在顯著的種族差異。
　　 第二部分全血中他克莫司的LC/MS/MS分析方法的建立與腎移植患者藥動學研究
　　 目的：
　　 建立并驗證他克莫司的質譜檢測方法，并

10、應用于腎移植患者藥動學研究中。
　　 方法：
　　 1.建立他克莫司檢測的質譜方法、液相方法及全血樣本的萃取方法。
　　 2.進行全面的方法學驗證：包括方法的精密度、準確度、線性及最低檢測限、穩(wěn)定性及基質效應等。
　　 3.研究地爾硫卓對他克莫司藥動學的影響。
　　 結論：
　　 建立了LC/MS/MS分析方法檢測人全血中他克莫司濃度，該方法靈敏、特異、可靠、快速，并成功應用于他克莫司-地

11、爾硫卓藥物相互作用試驗。合用地爾硫卓可以提高他克莫司的濃度，并且C0與AUC0-12 h的相關性仍較好。
　　 第三部分相關基因多態(tài)性及地爾硫卓與早期腎移植患者他克莫司濃度的相關性研究
　　 目的：
　　 回顧性研究遺傳因素(CYP3A4、CYP3A5、MDR1及NR1I2基因多態(tài)性)及地爾硫卓對他克莫司濃度的影響，為實現(xiàn)他克莫司的個體化給藥提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 采用PCR-RFLP法檢

12、測CYP3A4、CYP3A5及MDR1基因多態(tài)性，采用PCR-直接測序法檢測NR1 I2基因多態(tài)性，術后第七天全血谷濃度(C0)為臨床TDM數(shù)據(jù)，分析各基因型及地爾硫卓與他克莫司濃度的相關性。
　　 結論：
　　 CYP3A5*3基因型與他克莫司濃度密切相關，且CYP3A5與CYP3A4、MDR1、NR1I2之間存在基因型相互作用。地爾硫卓能顯著提高他克莫司濃度，影響程度受CYP3A5*3基因型影響?？筛鶕?jù)CYP3A5*

13、3及地爾硫卓構建他克莫司劑量預測方程。
　　 第四部分五酯片對CYP3A5表達型患者他克莫司藥動學的影響
　　 目的：
　　 本部分研究將以CYP3A5表達型患者作為研究對象，以地爾硫卓作為陽性對照，比較五酯片和地爾硫卓對他克莫司藥動學的影響情況。
　　 方法：
　　 1.24例經(jīng)鑒定為CYP3A5表達型的腎移植患者在服用他克莫司至兩周待血藥濃度到達穩(wěn)態(tài)后隨機分為地爾硫卓組與五酯片組，每組各12例

14、。
　　 2.在試驗第1天，在給他克莫司前(0 h)和給藥后0.5，1，1.5，2，3，4，6，9，12 h取血。之后合用地爾硫卓(30 mg，每天三次)或者五酯片(0.54 g，每天三次)，合用兩周后(即試驗第15天)進行第二次取血，取血時間點同試驗第1天取血。全血中他克莫司濃度采用LC/MS/MS法檢測。
　　 結論：
　　 五酯片能顯著影響CYP3A5表達型患者他克莫司的藥動學，降低他克莫司的用量，且五酯片

15、的作用較地爾硫卓更顯著。合用五酯片時他克莫司C0與AUC0-12 h相關性仍較好。
　　 第五部分CYP3A5*3基因型聯(lián)合地爾硫卓/五酯片干預他克莫司用藥的前瞻性研究
　　 目的：
　　 通過前瞻性研究，驗證結合CYP3A5*3基因型及地爾硫卓/五酯片預測劑量的他克莫司給藥方案。
　　 方法：
　　 1.試驗分組
　　 (1)地爾硫卓組
　　 腎移植患者術前進行CYP3A5*3基

16、因型檢測，CYP3A5表達型與非表達型患者各16例，隨機分入試驗組與對照組，試驗組與對照組各含CYP3A5表達型及非表達型患者各8例。試驗組合用地爾硫卓，采用方程預測劑量給藥；對照組不合用地爾硫卓，采用常規(guī)劑量給藥(0.05-0.075 mg/kg，bid)。
　　 (2)五酯片組
　　 腎移植患者術前進行CYP3A5*3基因型檢測，32例CYP3A5表達型患者隨機分為試驗組與對照組，每組各16例。試驗組合用五酯片，他克

17、莫司每次劑量為臨床最低劑量0.05 mg/kgi對照組采用常規(guī)劑量給藥。
　　 2.評價指標：
　　 他克莫司起始劑量(僅五酯片組)、首劑他克莫司穩(wěn)態(tài)谷濃度、首劑穩(wěn)態(tài)谷濃度超出治療窗的比例、達治療窗前劑量調整次數(shù)、達治療窗時他克莫司所需劑量、術后兩周內的急性排斥發(fā)生率及術后兩周(第14天)的血肌酐水平。
　　 結論：
　　 對于CYP3A5表達型患者，地爾硫卓方案和五酯片方案均能更準確地預測他克莫司的給藥